海洋微生物来源纤溶酶的研究

心脑血管栓塞疾病日渐受关注，但是现用药物不能很好地溶解形成时间较长的血栓，影响治疗效果，开发新型药物，特别是微生物药物，是适应社会需求的一条有效途径。我们自主从广西沿海红树林中分离到海洋枯草芽孢杆菌HQS-1，其每毫升原发酵液溶栓活力即相当于5000单位的尿激酶，酶被分泌到培养液中，易于与另一个具有极弱溶血性的膜蛋白分离；发酵特性稳定；纯酶不溶解血细胞，不分解纤维蛋白原；最佳酶促反应条件接近人体生理状态；能持久分解形成时间较长、成分复杂的血栓，具有很高的研究应用价值。本研究将完善酶的发酵和纯化，展开对该酶结构及其溶栓机理的研究。重点解析在不溶解纤维蛋白原和血细胞的条件下，该酶持续溶解顽固血栓的机理，并评价其应用中的安全性。

紫外诱变枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HQS-1获得高产纤溶酶且稳定性良好的菌株HQS-3，通过单因素、正交实验和响应面方法优化并确定菌株HQS-3在250 ml摇瓶中产纤溶酶的最适条件，获得菌株在3.6 L发酵罐上的发酵工艺参数。从菌株HQS-3中分离出电泳纯纤溶酶。该酶分子量为26 KDa，为单链蛋白质；等电点在9.0-9.2之间，高于其它来源于芽孢杆菌属Bacillus的纤溶酶。此酶在pH 6.0-10.0和25-37℃范围内稳定，最适酶促反应pH值和温度区间分别为8.0和45-50℃。纤溶酶活力被PMSF，EDTA，Cu2+，Zn2+和Co2+显著抑制，其按α、β、γ-γ链的顺序直接分解纤维蛋白，这说明该海洋性纤溶酶为类血纤维蛋白溶酶丝氨酸金属蛋白酶，在芽孢杆菌属中发现尚属首次。该酶在体外不引发溶血现象，显示了其在溶栓治疗上的安全性。纤溶酶在胃蛋白酶存在下酶活损失严重，而在模拟的人肠道环境中具有一定的稳定性。体外溶栓实验表明，作用时间为32 h时，对于形成2个月的顽固性血栓，纤溶酶的溶栓率为70.44%，而尿激酶基本上不能溶解顽固性血栓。首次从枯草芽孢杆菌中分离得到具有强效抗凝血作用的纤溶酶；体外抗凝血实验结果显示，发酵粗酶液的抗凝血酶活力为108 ATU/ml，相当于100 U/ml水蛭素的抗凝血效果，而尿激酶不具备抗凝血能力。来源于海洋枯草芽孢杆菌HQS-3的纤溶酶具有开发成新一代溶栓药剂和功能性食品的巨大潜力。