温度胁迫强化生物高分子聚γ-谷氨酸合成的代谢机制研究

Poly-γ-glutamic acid, abbreviated as PGA, is a microbial biodegradable polymer with wide application in the field of food, medicine, cosmetics, agriculture and environmental protection etc. Due to the lack of overall and rational understanding in the PGA synthesis and metabolic regulation mechanism, its fermentation level encounter bottleneck and restrict severely the application. In the process of producing PGA by Bacillus subtilis GXA-28, the results showed that temperature stress can significantly improve the yield of PGA and the substrate come from endogenous and exogenous in two ways. The goal of this research is to reveal the metabolic mechanism of PGA production improvement responsing to temperature stress, from a relevance perspective of exogenous glutamate uptake, endogenous glutamate supply and PGA synthesis. It is based on the study of metabolic changes and functions of cell membrane structure and glutamate transport system, and identification of the key nodes and key enzymes in the endogenous glutamate pathway. The resutls will be provide more experimental evidence to elucidate the regulatory mechanism of PGA synthesis and metabolism from a new perspective, and provide theoretical guidance to improve PGA producing strain by metabolic engineering, which has important theoretical and practical significance.

聚γ-谷氨酸（PGA）是一种微生物源可降解高分子聚合物，在食品、医药、化妆品、农业和环境保护等领域具有广泛用途。由于缺乏对其合成及代谢调控机制的全局性和机理性认识，PGA发酵水平的进一步提高遇到瓶颈，严重制约其推广应用。申请人在利用自主知识产权菌株Bacillus subtilis GXA-28发酵生产PGA过程中发现：温度胁迫能够显著提高PGA产量，且底物来源存在外源性和内源性两条途径。本研究拟在这种温度胁迫条件下，通过探明细胞膜结构和谷氨酸转运系统在外源性谷氨酸摄取中的代谢变化和功能、鉴定内源性谷氨酸来源途径中的关键节点和关键酶，进而从外源性谷氨酸摄取-内源性谷氨酸供给-PGA合成的关联角度揭示温度胁迫强化PGA合成的代谢机制。研究结果有望从新的视角为阐明PGA合成及代谢调控机制提供实验依据，并为利用代谢工程改良PGA产生菌提供理论指导，具有重要的理论和实践意义。

本项目围绕温度胁迫能够显著提高Bacillus subtilis GXA-28发酵生产聚γ-谷氨酸（PGA）的产量，且底物来源存在外源性和内源性两条途径这一现象开展研究。在温度胁迫条件下，利用稳定性同位素示踪技术分析B. subtilis GXA-28合成PGA的底物来源途径，在此基础上分析细胞膜结构和谷氨酸转运系统在外源性谷氨酸摄取中的代谢变化和功能、鉴定内源性谷氨酸来源途径中的关键节点和关键酶。具体研究结果如下：（1）温度胁迫条件下PGA的底物来源比例存在差异。42℃下PGA底物来源于葡萄糖的比例约为4%；37℃和28℃下，PGA底物来源于葡萄糖的比例升高至6%。此外，外源谷氨酸摄取率和利用率随温度升高而增加。（2）温度胁迫条件下B. subtilis GXA-28的细胞形态和细胞膜结构存在差异。随发酵温度升高，细胞被粘结在一起，细胞形态变形严重且出现细胞碎片；菌体细胞膜中的不饱和脂肪酸C16:1和C18:1含量下降，而C12:0和C14:0脂肪酸含量总和及C16:0和C18:0脂肪酸含量增加；细胞膜通透性增加而完整性降低。（3）42℃条件下，谷氨酸转运蛋白基因gltP和gltT的转录量分别提高了1.37倍和1.79倍。（4）温度胁迫下内源性谷氨酸合成途径中的代谢物浓度、基因转录水平和关键酶活力存在差异。随发酵温度升高，细胞内葡萄糖浓度和葡萄糖转运蛋白基因glcU转录量显著上调；α-酮戊二酸节点的icd、sucA、gudB和rocG转录量均不同程度上调，而gltA和gltB转录量下调；α-酮戊二酸节点酶活力变化与相应基因转录水平具有一致性。本项目从外源性谷氨酸摄取-内源性谷氨酸供给-PGA合成的关联角度探究了温度胁迫强化PGA合成的代谢机制，为利用代谢工程策略改良PGA产生菌提供了理论指导。