胶质母细胞瘤及其干细胞中差异性表达miR16调控瘤干细胞增生和分化的作用及机制

研究表明，恶性胶质瘤存在胶质瘤干细胞（GSCs），并认为GSCs是复发和放化疗耐受的根源。我们前期研究发现，miR-16在胶质母细胞瘤细胞与GSCs中呈现差异性表达，预测其靶基因包括多个细胞周期调控蛋白CCND1、CCNE1、CDK2、CDK6和凋亡抑制基因bcl-2等，可能对调控GSCs的增殖和分化具重要生物学意义。本项目拟通过体外、体内转染miR-16（胶质母细胞瘤细胞）/敲减miR-16（GSCs），研究其靶基因mRNA和蛋白表达的改变及生物学效应，探讨GSCs中高表达的miR-16对瘤细胞和移植瘤细胞周期、增殖、凋亡和分化的作用及机制；回顾性研究miR-16及其靶基因表达对胶质母细胞瘤患者预后的影响，揭示miR-16在胶质母细胞瘤进展中的作用及机制。从细胞、动物、人体不同层面阐明miR-16调控GSCs增生和分化的机制。

胶质瘤干细胞（GSCs）被认为是恶性胶质瘤侵袭、放化疗抵抗和复发的根源。本项目发现miR-16在GSCs比分化型胶质瘤细胞(GCs)显著性高表达。因此分别对胶质母细胞瘤细胞（GCs；SGH44、U87、U251）和GSCs （SGH44-GSC、U87-GSC、U251-GSC）转染miR16 mimics/inhibitor，以及甲基化抑制剂5’-AZA和PBA干预，流式细胞术检测细胞周期和凋亡、CCK8实验检测细胞增殖、划痕实验和Transwell实验分析侵袭能力。BSP检测miR16甲基化状态，DNA测序检测miR16突变、SNP等，qRT-PCR和免疫荧光或免疫组化检测miR-16及其靶基因CCND1、CCNE1、CDK2、CDK6、bcl-2mRNA和蛋白水平的变化。在体水平从小鼠皮下移植瘤及脑内原位移植瘤观察miR-16及相关基因对GCs和GSCs成瘤的影响。100例人胶质母细胞瘤（GBM）样本检测miR-16及其靶基因和相关基因表达，分析miR-16与患者存活率的关系。结果发现GSCs阻滞于G0/G1期，转染miR-16 mimics组G0/G1期细胞增加。甲基化抑制剂促进细胞进入到G2/M期和凋亡。转染miR16 mimic 组细胞增殖不同程度抑制，而转染miR16 inhibitor各组细胞显著增殖，且GCs与GSCs比较有显著性差异，P<0.05。GCs和GSCs中miR-16存在甲基化位点，随甲基化抑制剂5’-Aza和PBA剂量加大GCs和GSCs增殖显著抑制，P≤0.05。高剂量的5’-Aza3µM和PBA3mM联合作用，miR-16表达不同程度恢复，且 GSCs组显著上调，P<0.05。miR16 mimic抑制克隆形成，显著减低GCs的迁移和侵袭能力，P<0.01。转染miR16 inhibitor的U251-GSCs形成的脑原位移植瘤microPET 18F-RGD摄取值显著高于其他组。GBM样本中miR16低表达和靶基因高表达，且CD133和 Ki67高表达，与患者的自由进展生存期和死亡风险率有关。研究表明miR-16通过靶基因参与GBM细胞周期，在增殖和分化中起重要促进作用。甲基化抑制剂有明显的促进GCs和GSCs凋亡作用；miR-16影响GBM患者预后，miR-16、CD133和 Ki67均可作为GBM预后的分子标记物。