miR-16被DLEU2转录、靶向调控Wip1-ATM-p53反馈环路在维持胶质瘤干/祖细胞"干性"中的作用及机制

Glioma stem-like cells derived from gliomas which are roots of tumour progression,recurrence and resistant to radiotherapy and chemotherapy. Our studies reveal the over-expression of miR-16 significantly suppressed differentiation and proliferation of gliomas stem-like cells, through inducing G0/G1 cells cycle arrest. Bioinformatics have forecasted the tumor suppressor DLEU2 as host gene of miR-16, and transcriptional regulate miR-16. miR-16 post- transcriptional control Wip 1 expression. "Wip1-ATM-p53" signaling feedback loop is DNA repair key signal pathway.Wip1 function to abrogate cells cycle checkpoint and inhibit senescence, apoptosis, DNA repair, and production of inflammatory cytokines and it is overexpression in several types of human cancers and has oncogenic function. The study to determinate the role of these key factors of the signaling feedback loop through to test mutation, loss of heterozygosity,amplification, phosphorylate, histone acetylation, methylation status to identify the regulation of "Wip1-ATM-p53" the stress signaling loop in glioma stem-like cells to understand the effect of gliomas stem-like cells in the gliomas resistant to radiotherapy, chemotherapy, tumour progression and recurrence to guide clinical targeted therapy and stratify gliomas patient treatment regimens.

存在于恶性胶质瘤中的胶质瘤干细胞（GSCs）被认为是复发和放化疗抵抗的根源。我们前期发现，GSCs较分化型胶质瘤细胞miR-16呈显著差异高表达，通过调控其靶基因使GSCs阻滞于G0/G1期，抑制GSCs增殖和分化，但是否和如何影响瘤细胞"干性"以及对生物学行为、患者预后的影响，尚待深入研究。新近发现miR-16被DLEU2基因转录，且靶向调控Wip1以及Wip1-ATM-p53反馈环路。本项目拟通过荧光素酶报告和转染实验验证转录调控和靶向关系，深入研究DLEU2/miR-16调控Wip1-ATM-p53通路中关键分子的突变、缺失、扩增、SNP、磷酸化、甲基化和组蛋白修饰等变异在维持GSCs"干性"中的网络化级联、反馈、协同等效应机制，探讨miR-16通过调控Wip1通路维持GSCs"干性"分子机制，并分析上述通路关键分子对胶质瘤患者预后的影响，为胶质瘤诊断、治疗和预后提供新的分子标记物。

背景：胶质母细胞瘤中干细胞（GSCs）是恶性胶质瘤侵袭、放化疗抵抗和复发的根源，其机制涉及miRNAs对信号通路的调控异常。主要研究内容：通过体内、体外和临床回顾性研究，探讨胶质母细胞瘤组织和裸鼠移植瘤中DLEU2/miR-16调控ATM-p53-Wip1通路对进展和预后的影响，验证胶质瘤中DLEU2转录调控miR-16以及 miR-16靶向调控Wip1基因关系，探讨miR-16 被DLEU2转录、靶向调控Wip1通路在 维持GSCs“干性”中的遗传学变异和表观遗传学变异机制。重要结果、关键数据： 200例胶质母细胞瘤总生存期（OS）短与miR-16低表达、Wip1 高表达、GSCs干细胞标记（SOX2、nestin）高表达明显相关。裸鼠原位移植瘤miR16 agomir组平均肿瘤体积显著小于miR16 antagomir组（P< 0.01）， miR-16具有抑制移植瘤生长作用，GSCs 组平均肿瘤体积大于瘤细胞组（P< 0.05），支持 GSCs具有致瘤作用。双荧光素酶报告、Chip-PCR和转染实验验证DLEU2/miR-16转录调控和miR-16调控Wip1靶向关系。胶质母细胞瘤组织和细胞中DNA测序均未发现miR-16突变和SNP。瘤细胞及GSCs转染agomir/mimic或miR16 antagomir/inhibitor后miR16表达与Wpi1 mRNA/蛋白表达负相关、与ATM、P53和pATM、pP53 mRNA/蛋白表达正相关。BSP检测胶质瘤细胞和GSCs均出现miR-16甲基化，甲基化抑制剂5-AZA和组蛋白乙酰化抑制剂PBA处理瘤细胞和GSCs 后miR16表达上调、Wpi1mRNA/蛋白表达下调。miR16高表达具有肿瘤抑制作用（增殖减低、凋亡增加），抑制肿瘤迁移和侵袭。GSCs阻滞于G0/G1期，抑制GSCs增殖和分化。科学意义：本项目揭示胶质母细胞瘤细胞和GSCs中miR-16/DLEU2和ATM-p53-Wip1通路关键分子遗传学和表遗传学变异导致的失活对维持胶质瘤干/祖细胞“干性”的影响分子机制，分析上述通路关键分子对胶质瘤患者预后的影响，为胶质瘤诊断、治疗和预后提供新的分子标记物。为探索和开发GSCs“干性”通路的基因治疗提供实验基础和理论依据。