针尖增强拉曼光谱用于T细胞特异性受体结构表征的研究

Tip-enhanced Raman spectroscopy (TERS), which can simultaneously obtain the morphology with nano-scale resolution and the structural information with high sensitivity of the measured sample, will become a powerful tool of the structural characterization of single molecule. T cell receptor (TCR) is the main constituent of immune response, the structure characterization of TCR molecule in situ is a key issue to reveal the molecule mechanism of T cell immune response. In this project, it is required to establish a TERS system based on scanning probe microscope (SPM) and Raman spectrometer, which is suitable for the structural characterization of single molecule on the biological cell. By solving the essential issue of TERS measurement, including probe choosing and controlling, sample preparation, the exciting laser choosing and scanning controlling, signal acquisition, data processing, Raman spectrum assignment and the fusion of morphology and spectrum, in particular the recognition the near-field Raman spectrum from the captured TERS signal, it is hoped that both the morphology and structure of T cell receptor (TCR) on the T cell can be simultaneously obtained using the above TERS system. Moreover, the relationship between the structure of TCR and T cell immune response can be can be presented. Furthermore, it is also hoped that the difference of the molecule mechanism of the activation signal transduction between different T cell subsets can be supplied.

针尖增强拉曼光谱（TERS）技术可实现纳米尺度样品形貌和结构信息的同步探测，是单分子结构表征的利器。T细胞表面特异性受体（TCR）分子是产生免疫应答的主体，TCR结构及结构变化的原位探测和表征，是揭示T细胞免疫应答分子机制的核心。项目采用扫描探针显微镜与拉曼光谱仪融合构成针尖增强拉曼光谱仪，提出了系统解决TERS用于细胞分子测量时各种基础问题的思路与方案，包括：探针选择与控制、样品制备、激发光选择与调控、扫描控制与信号采集、数据处理与光谱识别、形貌与光谱信息空间对应指认等；提出了从直接测量的TERS信号中甄别和提取细胞分子近场增强拉曼信号的方法。通过项目研究，解决活细胞分子的原位TERS测量、处理与分析中的科学和技术问题，得到T细胞表面TCR分子形貌与拉曼光谱空间对应指认的方法，以期获得不同亚群T细胞活化过程中TCR结构及结构变化与免疫应答的关系，为其免疫应答的分子机制研究提供新手段。

项目以增强拉曼光谱实现单细胞水平上的分子识别和结构表征为目的，重点进行针尖增强拉曼光谱（TERS）系统构建、基于表面增强拉曼光谱（SERS）的细胞分子探针研制、基于光热和光动力或光化疗协同治疗的靶向载药体系构建、动态相位测量和SERS光谱成像融合的单细胞行为表征研究，取得了丰富的成果。. 项目采用扫描探针显微镜与拉曼光谱仪融合构建针尖增强拉曼光谱TERS系统，提出了系统解决TERS用于分子测量的思路与方案，包括：探针选择与控制、样品制备、激发光选择与调控、扫描控制与信号采集、数据处理与光谱识别、形貌与光谱信息空间对应指认等；对各种径向偏振光用于TERS系统的信号增强和稳定性进行系统研究，发现超高斯型径向光拉曼增强效果最佳；对金Au纳米结构局域增强及其法诺（Fano）共振拉曼散射增强进行大量模拟计算基础上，利用电子束曝光EBL分别制备金纳米环围四聚体结构和Au纳米粒棒微结构，实现主动表面等离子体激元SPPs与局域表面等离子体共振LSPR耦合，实现拉曼信号激发和发射的双增强，并将其分别用于TERS系统信号探测，极大提高了TERS信号的强度和稳定性；. 对Au-SiO2间隙纳米结构进行模拟分析的基础上，研制了多种细胞生物分子SERS纳米探针；细胞内H2O2定量表征的硼酸SERS纳米探针，建立了一套基于SERS成像的药物作用位点识别方法，构建了光热和光动力或光化疗协同治疗的靶向载药体系，基于SERS靶向金纳米给药体系的制备及其用于癌症的光热-化疗一体化治疗；. 对课题组专有的双通道动态相位测量系统与进行升级，用于活细胞生长和凋亡过程中相位变化的动态测量，提出了一系列细胞动态相位测量的方法和手段，包括双通道同时空域和时域偏振相移技术、自校正相移技术、两步空域载频相移等新方法，结合单细胞SERS光谱成像，进行细胞相位变化与拉曼光谱信息空间对应指认，其结果将为单细胞状态和行为精确表征了一种新的思路和方法；. 通过项目研究，解决增强拉曼光谱实现单细胞水平上分子识别和结构表征，为T细胞免疫应答分子机制研究提供了新的方法和手段。