多道偏振近场光学显微镜及在多色量子点标记TCR/CD3纳米微域构成研究中的应用

光学纳米成像是进行生物纳米微域及单分子行为探测的一项核心技术。项目采用近场光学显微镜（NSOM）结合纳米微域偶激子偏振荧光探测，用量子点(QDs)标记分子以增强单分子荧光强度和荧光寿命，建立多通道偏振扫描近场光学显微镜与多色量子点标记结合的测量系统（MCPNSOM/QD）。以T淋巴细胞活化过程中特异性受体复合物（TCR/CD3）纳米微域构成为研究对象，通过对多色荧光信号的测量、分析和识别，细胞表面超微结构形貌与多色荧光信号的融合、分子密度和荧光分子偏振状态的定量表征，研究构成TCR/CD3纳米微域的分子种类、密度、分布、取向、分子间的结合关系和相互作用，通过与流式细胞仪（FCM）的结果相比较，探寻TCR/CD3纳米微域构成及其与免疫应答的关系。应用上述测量系统和方法，研究在结核菌和艾滋病毒感染下，T淋巴细胞适应性免疫 TCR/CD3纳米微域启动免疫应答的分子机制。

用近场光学显微镜（NSOM）结合纳米微域偶极子偏振荧光探测，用量子点(QDs)标记分子以增强单分子荧光强度和荧光寿命，建立了多通道偏振扫描近场光学显微镜与多色量子点标记结合的显微成像系统（MCPNSOM/QD）。该成像系统不仅能够进行纳米尺度下多色荧光信号的同时探测，而且能够进行单分子荧光信号的成像和判读。利用所建立的MCPNSOM/QD显成像系统，研究了T细胞活化过程中特异性受体复合物（TCR/CD3）纳米微域构成的分子种类、密度、分布、取向、分子间的结合关系及其与免疫应答的关系。包括（1）对TCR/CD3纳米微域构成与膜脂筏GM1的空间分布可视化研究表明：GM1纳米微域是TCR/CD3纳米微域形成的诱导平台，对TCR/CD3介导的T细胞活化和PKCθ级联信号传导起极大的促进作用；（2）利用三维图像融合技术，对细胞表面超微结构形貌与多色荧光信号进行融合，对T细胞活化早期和晚期表达蛋白CD69 和CD71分子在细胞表面的空间定位研究表明： CD69聚集形成纳米微域并主要定位在细胞表面的凸起位置，而CD71聚集形成纳米微域则主要定位在细胞膜表面的凹陷位置，其中CD69纳米微域的凸起定位可能作为一个短暂的平台驱动TCR/CD3介导的信号传导，而CD71纳米微域的凹陷定位对转铁离子的内吞起积极的促进作用；（3）对不同亚群T细胞活化过程中CD4（或CD8）和CD25分子的空间分布研究表明：在调节性T细胞CD4+CD25high膜表面, 虽然CD4和CD25分子都分别聚集形成纳米微域，但CD4纳米微域与CD25纳米微域在空间的分布定位完全不重叠。在CD4+CD25low辅助性T细胞膜表面，虽然CD4分子聚集形成纳米微域但CD25分子是随机分布的；在CD8+CD25+膜表面，CD8分子和CD25分子都分别聚集形成纳米微域，并且这些纳米微域在空间的分布定位是重叠的。这一结果可能暗示CD25纳米微域的形成和对TCR/CD3纳米微域的偏离对调节性T细胞的产生及其免疫调节功能的形成密切相关；(4)对αβT细胞和γδT细胞活化过程中TCR/CD3纳米微域构成和及其偏振特性进行对比研究，结果表明：虽然 γδTCR/CD3纳米微域的分子密度低于αβTCR/CD3纳米微域，但前者的偏振度明显大于后者，这一结果将为解释γδTCR/CD3纳米微域诱导T细胞活化信号传导的分子机制提供了一种新的思路。