基于转运体垂钓技术的绵萆薢降尿酸药效物质发现研究

The traditional method to discover active material basis of TCMs mainly uses the bio-guide separation methods. This method usually needs tedious work and long time which makes the cost to be extremely high. Ligand bio-fishing technology could identify the active compounds rapidly, however, the preparation of binding protein and the connection between in vitro and in vivo experiment are the bottleneck of this method. Our group focus on discovery of the active material basis from TCMs to treat metabolic disease in recent years. Dioscorea spongiosa was found to have the activity of anti-hyperuricemia significantly. Further studies indicated that its pharmacological effects mainly related to the transporter of kidney rather than xanthine oxidase. This program will establish a rapid method to discover anti-hyperuricemia material basis from D. spongiosa through bio-fishing method based on nephritic cellular transporter. It is expected to provide a methodology for the rapid discovery of the active material basis from TCMs related to nephritic cellular transporter.

传统活性导向下药效物质发现模式具有周期长、成本高的弊端，生物垂钓技术可以实现快速鉴定药效成分，但垂钓蛋白的制备以及如何将药物体外垂钓与体内过程相结合成为制约该技术发展的瓶颈。本课题组多年来一直从事中药治疗代谢性疾病药效物质发现研究，在前期药理研究中发现绵萆薢具有显著的降尿酸作用，且其作用主要与肾脏GLUT9、URAT1转运体相关，而与黄嘌呤氧化酶无关。本课题拟在前期工作的基础上，建立一种基于转运体垂钓技术的药效物质快速发现方法。课题首先建立尿酸排泄转运体高表达细胞模型并制备活性细胞膜；然后以绵萆薢经大鼠口服后富集的血清/尿液成分群为模型药物，将转运体与其温孵，通过超滤-LC/MS法比较垂钓前后绵萆薢相关色谱峰变化，快速锁定潜在活性化合物；再采用定向分离方法大量制备活性单体，最后在整体动物水平上验证降尿酸活性，明确绵萆薢药效物质基础。本项目可以为作用于转运体的中药药效物质发现提供方法学借鉴。

课题围绕绵萆薢降尿酸药效物质发现开展了一系列研究。首先建立了绵萆薢基于离线二维色谱-质谱联用技术的 LC/MS 指纹图谱，确定了药材主要化学成分，同时明确大鼠口服绵萆薢提取物后，血浆、尿液的主要原型成分；课题还完成了GLUT9和URAT1转运体高表达细胞模型的构建，建立了具有生物活性的细胞膜提取方法，优化了细胞膜垂钓绵萆薢活性成分的孵育条件，结合LC-MS分析确定了潜在活性物质为薯蓣皂苷；本课题还建立了一种基于固体上样技术的制备型HPLC线性放大工艺，完成了薯蓣皂苷的快速定向分离；最后，课题开展了薯蓣皂苷在高尿酸血症小鼠模型（氧嗪酸钾造模，PO）上的药效学评价及整合核磁、液质联用技术的代谢组学研究，同时整合转录组学研究结果，最终明确：在PO诱导的高尿酸血症模型中，有52种代谢物与薯蓣皂苷的治疗作用密切相关，其中19种是脂类。这些代谢产物主要参与三羧酸循环、脂质代谢、氨基酸代谢和嘌呤代谢；转录组学研究表明：与正常对照组相比，PO组有89个基因的水平发生了显著变化。其中，薯蓣皂苷调节恢复了6个基因水平。这6个基因 (tx1b、Tsku、Tmem163、Psmc3ip、TCAP、Tbx15) 主要参与细胞周期和能量代谢。这些代谢物和基因可能为进一步研究薯蓣皂苷的治疗机制提供有用的信息。本研究初步明确了薯蓣皂苷降尿酸作用机制，不仅为降尿酸药物开发提供参考依据，同时也为中药药效物质基础快速发现提供方法学借鉴。