基于分子印记纳米磁珠“多靶垂钓-定向捕集”的中药活性代谢物质群的发现及药效物质基础研究

The analysis of active metabolites of traditional Chinese medicines (TCM) have long been one of the major challenges to chemists and analysts, for those metabolites are usually found in low concentrations with complex matrixes, and need complicated procedures. A novel molecular imprinted polymers (MIPs) technology, with the characters of specific recognition, high enrichment and widely practicality is developed to analyze the active metabolites for figuring out the effective substance of Polygonum cuspidatum. The optimized magnetic molecularly imprinted polymers (MMIPs) are synthesized by magnetic materials, SiO2 nanoparticles and a surface molecular self-assembly strategy. With the efficiently magnetic separation of MMIPs and the convenient mixing of different types of MMIPs, the groups of metabolites can be "fished" by multi-targets and "captured" with good selectivity. Combined with activity screening, this project elucidates the bioactive constituents of Polygonum cuspidatum using the in vitro multi-component identification by LC-Q-TOF/MS and the in vivo metabolites enrichment by MMIPs. The project provides great insights into the integrated effects of TCM (including the complex matrixes effects) and achieves the selective recognition and enrichment of metabolites from TCM. This technical platform bridges the multi-component profiling, active metabolites between pharmacodynamics, which has great significance for discovering minor bioactive constituents and elucidating integrative mechanism of TCM.

针对中药体内代谢物质含量低、组分复杂、分离繁琐的问题，本项目以中药整体作用为理论基础，选择虎杖体内处置的代谢物质群为研究对象，采用具有选择性识别、专属富集和广泛实用性的分子印记技术为手段，开展药效物质基础研究。采用磁性材料、纳米硅胶和表面分子印记技术，合成具有磁响应强、选择性高的表面分子印记纳米磁珠；根据磁珠分离简便和不同类型印记磁珠组合灵活的特点，实现对虎杖体内代谢物质群的"多靶垂钓"和"定向捕集"；采用复杂组分鉴定和活性筛选技术，阐明基于"原型成分-活性代谢物质群"的整体药效物质基础。本项目充分考虑中药整体（包括复杂的基质背景）作用特点，实现对中药代谢物质群的定向识别及组合富集；表征"原型物质谱-代谢物质群-药效"的体内外物质关系。为中药微量活性代谢物质的发现和药效物质基础的阐明提供新思路和新方法。

中药药效物质具有组分复杂、代谢物含量低、分离繁琐等问题，迫切需要建立一种基于中医药特点、符合整体观、具有高灵敏度的分离检测技术。本研究采用具有构效预定性、选择识别性和广泛实用性特点的分子印记技术，合成分子印记材料（MIPs），对中药及保健品中微痕量物质进行选择性富集；针对中药体内代谢物质群进行“多靶垂钓”和“定向捕集”；采用LC/Q-TOF-MS技术，阐述基于“原型成分-活性代谢物质群”的药效物质基础。本课题基于原有基础，设计合成以格列本脲、伐地那非、西地那非和多巴胺为模板分子的多种分子印记材料，用于植物保健品中违禁添加药物分析，以及血浆中代谢标示物多巴胺分析。此外，本课题引入树枝状分子结构，制备树枝状修饰的磁性纳米材料，以虎杖苷（polydatin, PD）、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(emodin-8-O-β-D-glucoside, EG)为模板分子，制备出PD-MIPs和ED-MIPs。通过扫描电镜、红外光谱、磁强度饱和曲线、X射线衍射、氮气吸附/解吸附实验，对MIPs进行表征，结果表明该磁性纳米材料，核壳层表面可控、有序、致密。通过静态吸附、动态吸附与解吸附、选择性吸附实验对MIPs吸附性能进行评价。结果表明，MIPs最大吸附量分别为221 µmol/g和190 µmol/g，20min内达到吸附平衡和解吸附平衡；MIPs对结构类似物有较好的吸附性和选择性，而对非类似物无选择性。本课题成功地合成出稳定、高效、具有特异性识别功能的PD-MIPs和ED-MIPs，分别运用该MIPs对灌胃虎杖提取物后的大鼠血浆生物样品进行选择性磁性分散萃取，结合LC/Q-TOF-MS技术，共鉴定43个化合物，包括18个芪类、20个蒽醌类和5个其它类代谢产物。并将MIPs与传统预处理方法：蛋白沉淀、液液萃取、SPE进行基质效应、提取效率和提取容量等指标进行比较。结果表明，本课题合成的MIPs能够显著的降低生物样品质谱分析的基质效应，提高目标化合物群的提取效率和提取容量。磁性分离免去了复杂的萃取和离心等操作。该项目的分子印记“多靶垂钓”和“定向捕集”适用于中药提取物复杂体系的代谢研究，与传统的单体给药后分析代谢物方法相比，更充分考虑中药整体（包括复杂的基质背景）作用的特点。分子印记聚合物能够快速、选择性富集目标物质群，为中药复杂样品分析提供靶向、高效的分析方法。