LncRNA MEG3/miRNA-21/P38 MAPK调控轴在病毒性心肌炎常见致病病毒CVB3复制中的作用及机制研究

CVB3 is one of the most common causes of viral myocarditis in infants and young children, viral replication in the heart and other tissue could induce acute damage and inhibition of viral load could alleviate tissue damage, we previously proved that miRNA-21 and p38 MAPK signaling pathway participate in CVB3 replication process and overexpression of miRNA-21 could inhibits phosphorylation of p38 MAPK protein and depress CVB3 replication. We also found LncRNA MEG3 was elevated in the cardiac muscle of CVB3 infected mice and inhibition of LncRNA MEG3 induced viral repression. LncRNA MEG3 contains complementary sequence of seed sequence of miRNA-21, both of which were highly expressed in cytoplasm, we infer LncRNA MEG3 could modulate miRNA-21 and p38 MAPK signaling pathway and final CVB3 infection. We will apply luciferase assay, RNA pull down, inhibition and overexpression, NanoString, RNAscope assay to verify that LncRNA MEG3/miRNA-21/P38 MAPK axis functions in the process of CVB3 replication in the molecular, cellular, and animal level, we will further analyze the regulatory mechanism of LncRNA MEG3. Our work will supply more understanding on the mechanism of CVB3 replication and may be helpful for the therapy of CVB3 infecion.

抑制柯萨奇B3病毒（CVB3）在心脏等组织中的复制可减轻病毒性心肌炎的损伤，我们前期在细胞和动物水平证明过表达miRNA-21可抑制P38蛋白磷酸化并降低CVB3复制。CVB3感染后小鼠心肌中LncRNA MEG3表达显著升高，抑制其表达后病毒复制下降。该LncRNA在胞质中高表达，并含有miRNA-21 seed sequence的互补序列，由此我们推测LncRNA MEG3可调控miRNA-21并作用于P38通路最终影响CVB3的复制。我们拟应用荧光素酶报告实验、RNA pull down、抑制与过表达、NanoString、RNAscope等技术，从分子、细胞至动物水平研究LncRNA MEG3/miRNA-21/P38 MAPK调控轴影响CVB3复制的过程及机制研究，同时拟对LncRNA MEG3的调控机制进行分析。该项目为深入理解CVB3的复制机制，抑制病毒复制提供治疗靶点。

背景：我们之前证明P38 MAPK通路的活化在CVB3复制过程中起促进作用，而P38 MAPK的激活受miRNA-21的调控。越来越多的证据表明长非编码RNA（lncRNAs）在多种病毒感染过程中起着调节因子的作用，但LncRNAs在CVB3诱导的急性病毒性心肌炎中的作用机制尚未明确阐明。我们之前的研究表明，CVB3感染可增加小鼠心脏中LncRNA MEG3的表达，论文也报道了LncRNA MEG3可调节miR-21，我们推测LncRNA MEG3/miR-21/P38 MAPK轴在CVB3感染过程中起作用，LncRNA MEG3可通过调节miR-21调节CVB3的复制。.主要研究内容：通过实时定量PCR技术检测在CVB3感染HELA细胞和TE671细胞后胞质内LncRNA MEG3的表达；在体外进行荧光素酶报告分析和RNA-pull down实验以验证LncRNA MEG3与miRNA-21的关系；在体外和体内抑制LncRNA MEG3以检测其对miRNA-21的功能，P38 MAPK通路活化状况以及对病毒复制的影响。结合生信分析技术和细胞学实验，确定CVB3感染过程中LncRNA MEG3上游的调控因子。.重要结果和关键数据：在CVB3感染后48小时，发现LncRNA MEG3在HELA和TE671细胞质中表达上调，通过荧光素酶实验和RNA-pull down实验证明LncRNA MEG3可以直接作用于miRNA-21发挥吸附作用。MEG3的抑制导致miR-21的上调，miR-21可以通过抑制P38-MAPK信号抑制CVB3的复制。此外，在小鼠CVB3感染之前，使用含有LncRNA MEG3 shRNA序列的腺相关病毒抑制LncRNA MEG3的表达，发现miRNA-21表达上调，P38 MAPK信号通路活化水平降低，心脏中的病毒复制受到抑制，同时抑制LncRNA MEG3后也可以减轻心脏损伤，从而改善小鼠的存活率。进一步，结合生信分析技术和细胞学实验，我们确定LncRNA MEG3表达受到CREB5的调控，并且抑制CREB5后，CVB3的感染水平降低。.科学意义：我们确定了在CVB3感染过程中存在着LncRNA MEG3/miR-21/P38 MAPK调控轴，在体内、外实验验证可以通过抑制LncRNA MEG3来降低CVB3的复制水平。