利用核糖体展示定量研究果蝇母体基因的mRNA翻译及其调控机制

Maternal genes play key roles in animal embryonic development and human hereditary diseases. The early embryo of Drosophila melanogaster has been established as a model system to investigate the expression patterns of maternal genes and the regulatory principles of their downstream target genes. These studies systematically analyze the contributions of maternal genes to embryonic patterning. mRNA translation is an important process during the formation of the protein concentration gradients of maternal genes; however, limited by the technique bottleneck, it still lacks of direct quantification of the parameters of maternal gene translation processes. We propose to use the ribosome profiling and deep sequencing techniques, which have already been developed in our group, to measure the translational efficiencies at the genome-wide scale in mature oocytes and early embryos. We will distinguish the paternal transcripts of zygotic expression from the maternal transcripts by single nucleotide polymorphisms between the parental alleles. After measuring the translational efficiencies of maternal genes, we will build the model of morphogen gradient formation and the model of how the downstream genes respond to such gradients. Besides the work in wildtype strains, we will use the same experimental and analytical procedures to study the artificially selected strains that lay embryos of distinct sizes and the mother flies that are cultured in different nutrient conditions. Finally, we will use genetic manipulations, including overexpression, knockdown and knockout, to screen for factors such as small regulatory RNAs and general translation machinery that may affect the translational efficiencies of maternal genes.

母体基因在动物胚胎发育和人类遗传疾病中起重要作用.果蝇早期胚胎是研究母体基因表达及其调控模式的范例.已有研究系统阐释了母体基因在胚胎发育模式决定中的贡献.然而技术瓶颈导致关于母体基因mRNA翻译的在体定量数据匮乏. 母体基因mRNA翻译是其蛋白梯度形成中的重要过程,本项目将在三个层面上对其展开研究.1.采用核糖体展示和高通量测序的方法,在果蝇成熟卵细胞和早期胚胎中测定基因组水平mRNA翻译效率图谱,并利用母本和父本之间的多态性位点分离早期胚胎中表达的父源转录本以鉴别母体表达和合子表达.2.利用该流程，分析不同母本的遗传背景和营养条件对母体基因翻译的影响.3.结合遗传操作对影响母体基因翻译的因素进行筛选，包括卵细胞和早期胚胎中高表达的小RNA和蛋白合成相关因子.通过这些工作,构建母体基因蛋白质梯度形成和调控下游基因表达的精准模型,探究母体基因翻译调控在胚胎发生发育中的作用.

转录后调控可能导致mRNA和蛋白质丰度之间的显著差异，而翻译调节对蛋白质水平的控制起到重要作用。同时，在细胞在应对内部或外部刺激做出反应时，相较转录重编程，翻译效率的变化更为快速。依托本项目自主，我们建立并优化了不同样本中测定基因组水平翻译效率图谱的实验和分析技术，并针对多个相关的重要生物学问题展开了研究，包括：1、绘制果蝇成熟卵细胞和早期胚胎中的母源基因mRNA翻译效率图谱，鉴定出果蝇早期胚胎中翻译效率显著变化的母源基因；2、建立母体基因表达、形成蛋白质梯度并调控下游基因的定量模型，并探索了其与发育模式鲁棒性的关联；3、揭示翻译起始因子paip1缺失不仅如预期显著降低了总体的翻译水平，而且特异性降低了参与翻译复合体的多个基因，并进一步引起细胞凋亡和发育停滞；4、在果蝇整个生命周期中，tsRNAs于1-2天的蛹期表达量最高，并且对靶基因的mRNA水平有显著抑制作用，而在翻译水平的影响较小；5、斑马鱼早期胚胎发育中，BHPF处理对m6A修饰的mRNA翻译效率有显著影响；6、绘制人RPE-1细胞氨基酸饥饿应激中翻译效率图谱的动态变化，揭示核糖体阻滞是可能的关键分子机制。这些数据和分析结果，揭示了翻译水平调控在重要细胞和发育过程中的作用。..（2）研究目标完成情况。.目标1. 在基因组水平上绘制果蝇母体基因翻译效率的图谱。完成。.目标2. 建立母体基因表达、形成蛋白质梯度并调控下游基因的定量模型。完成。阐释母体基因的翻译调控对胚胎发育的影响。待完成。.目标3. 发表论文。已发表标注本项目资助的SCI论文1篇，已录用的待发表SCI论文1篇。另有已投稿的标注本项目资助的SCI论文4篇。