Med13在卵母细胞减数分裂成熟、早期胚胎和生殖道发育中的功能研究

Mediator Complex is an important co-activator involved in RNA polymerase II mediated transcription. Med13, a subunit of Mediator Complex, was highly expressed in oocytes and one/two-cell stage embryos. Med13 knockdown affected oocyte maturation and early embryo development. Full Med13 homozygous knockout mice died early while heterozygous knockout mice showed vaginal agenesis and this phenotype was very similar to MRKH disease in human. However, how does Med13 regulate these physiological processes is unclear. Our preliminary work shows that Med13 is involved in chromosome segregation and embryonic genome activation, and also regulates the expression of genes related to the reproductive tract development. Therefore, we will use gene RNAi in vitro and gene knockout in vivo technology in this project, to study 1) the effects of Med13 knockdown /knockout on chromosome segregation, especially on the formation and hydrolysis of Cohesin during oocyte maturation; 2) the categories, signal pathway and the kinds of same transcription factor combined of genes affected on transcription in the arrested Med13 knockdown/knockout embryos and try to overexpress some important genes in signal pathway to rescue the development of arrested embryos; 3) the abnormal genes expression on the reproductive tract of Med13 heterozygous knockout mice and try to find the mechanisms regulated the development of the reproductive tract in combination to endocrine secretion in vivo and the relationship between Med13 and human MRKH syndrome.

Mediator复合体是Pol II介导转录中的共激活因子，其亚基Med13在卵母细胞和二细胞前胚胎中高表达，Med13敲低处理会导致卵母细胞不成熟和早期胚胎发育停滞，其半基因敲除鼠表现阴道发育不全，该表型与人类生殖疾病MRKH综合征极为相似，但Med13是如何调控这些生理过程还不清楚。前期研究表明Med13参与调控卵母细胞染色体分离和胚胎基因组激活，并影响与生殖道发育相关基因表达。本项目以RNA干扰和基因敲除为手段，深入研究1）Med13敲低/除对卵母细胞成熟中染色体分离的影响，尤其对黏连蛋白形成与水解的影响；2）Med13敲低/除的发育停滞胚胎中转录被影响的基因类别、信号通路归属及相结合转录因子的种类，并通过外源表达相关通路中重要基因来挽救胚胎发育；3）Med13半敲除母鼠的生殖道上异常表达的基因并结合激素水平来寻找调控生殖道发育的重要机制，并探索Med13与人类MRKH综合征的关系。

卵子受精后，精卵各自所携带的染色体经过重组形成新的胚胎基因组，各种转录因子与新形成的胚胎基因组相结合来启动胚胎基因组的转录，Mediator复合体是RNA聚合酶II所介导的转录活动中的一个重要共激活因子。在不同类型的细胞中，不同的转录因子在接收特定的信号后就会和Mediator复合体中的某个特定亚基发生相互作用，促使RNA聚合酶II及通用转录因子在特定基因的起始序列上聚集并形成预起始复合物，进而调节基因的表达，从而使细胞表现特定的功能。本研究主要对Med13敲低的晚期2细胞胚胎进行基因表达分析，从而确定Med13对哪类基因的表达进行调控并找到被影响基因的启动子区的共同的DNA结合域，从而推断Med13特定结合的转录因子，并确定Med13与该转录因子间的调控关系。同时构建和繁育在卵子和精子上特异性敲除Med13的小鼠，从而获取Med13全敲除的胚胎，从体内实验进一步来验证Med13的功能，最终期望找到Med13对应的调控基因，并通过外源表达该类基因来挽救胚胎发育。研究结果发现Med13在卵子、1细胞和2细胞阶段的mRNA水平很高，到4细胞至桑椹胚就明显降低，到囊胚阶段又恢复高表达。早期胚胎发育过程中Med13主要来源于胚胎基因组，并定位于胚胎卵裂球核内。Med13敲低后的胚胎有60%的胚胎会停滞在2细胞期，有40%的胚胎会停滞在4细胞期，敲低后对胚胎内RNA转录、DNA复制和DNA损伤产生影响。RNA-seq结果显示1201个基因发生了上调调控，2203个基因发生了下调调控。GO 功能分类和KEGG 信号通路鉴定发现，这些基因主要是与DNA的复制和染色质重构相关，过表达Smarca4和Smarcc1可以部分挽救胚胎的发育。Med13主要通过基因启动子区域的E2F结合区来调控特异性基因表达，从而调控早期胚胎发育过程中的DNA复制和细胞周期等。Med13敲除后的胚胎却能发育到囊胚，但滋养层细胞的数目会下降，并引起Nanog等表达下降，最终死在12.5天。此外Med13的敲除会引起胚胎中Med13L的代偿性表达，从而延缓了Med13胚胎的致死。本研究结果将为动物早期胚胎发育的调控机制提供新的资料，同时为人类辅助生殖技术的完善提供坚实的理论基础。