利用复合纳米材料构建干细胞生长微环境促进前交叉韧带重建后腱骨止点愈合

前交叉韧带（ACL）损伤是最常见的运动创伤之一，ACL重建后腱骨止点处愈合缓慢，影响患者的早期康复。我们通过研究腱骨止点的愈合过程，发现早期骨形成及骨髓间充质干细胞（MSC）的募集、增殖和分化是促进愈合的关键。前期实验结果证实过表达成骨特异性基因Runx2可以促进局部成骨以及重建韧带腱骨止点的愈合。因此，本研究拟使用纳米材料构建临时细胞外基质，用噬菌体展示技术筛选MSC特异性亲和多肽对纳米材料进行表面修饰，探讨其是否可募集自体MSC以及对MSC特性的影响；通过该材料缓释非病毒载体PEI-Runx2复合物，探讨其是否可增强MSC向成骨细胞的定向分化能力。我们希望通过上述方法最终可在体内促进局部成骨作用，并促进体内腱骨止点的愈合，增强重建韧带的生物力学强度。本课题的完成可为促进ACL重建术后腱骨愈合和止点形成的临床研究提供实验依据，并为揭示MSC在人工合成纳米材料中的生物学行为特点奠定基础。

前交叉韧带（ACL）损伤是最常见的运动创伤之一。目前ACL断裂的主要治疗方法是关节镜下自体腘绳肌腱移植重建，术后移植物将与骨道壁愈合（腱-骨愈合），形成新的韧带止点。ACL重建后早期‘腱-骨止点’愈合的质量是决定ACL重建术效果的关键因素之一。本课题构建了干细胞亲和多肽修饰的Runx2缓释功能支架，利用此支架材料结合干细胞与自体肌腱移植物构成复合体重建ACL，探讨该功能支架对干细胞粘附、募集与增殖及其向成骨细胞分化能力的影响及机制，并最终促进局部成骨、腱骨止点的愈合。. 以正常ACL止点结构为基础，用静电纺丝法制备了无纺与网格状PLLA纳米纤维膜，其中网格状的纳米纤维分布方式随部位而改变，在网格框的边缘出现分层且相互交叉的纤维，类似ACL止点处胶原纤维的排列方式。大鼠骨髓间充质干细胞与滑膜干细胞在膜上生长状态良好，细胞能够沿着纤维的方向铺展，形成不同的形态和细胞骨架走行。各项成骨分化指标均提示网格状纤维膜可以较无纺膜更能促进干细胞的成骨分化。机制研究结果显示骨髓间充质干细胞在网格状纤维膜上能够合成更多的整合素a5、b1，以及RhoA/ROCKII及ERK信号通路明显活化，而特异性抑制这两条信号通路后，细胞骨架的正常分布被打乱，成骨特异性基因Runx2的表达水平也下调。.利用噬菌体展示技术分别筛选出骨髓间充质干细胞、滑膜干细胞特异性亲和多肽，并将亲和多肽共价连接于纳米纤维膜上，通过电镜观察、免疫荧光染色等方法证实了表面修饰亲和多肽的纳米纤维支架能够特异性的将干细胞吸附在支架上，并促进其增殖与成骨分化。同时，本实验中制备的Runx2缓释功能支架，可在1个月内逐渐释放Runx2因子，使其在术后康复早期达到较长期的释放。利用Runx2缓释功能支架进行裸鼠皮下异位成骨实验及兔ACL重建手术，组织学、生物力学、影像学评定结果证实：该功能支架有显著的促进腱骨止点愈合效果，并明显优于对照组。. 因此，本课题构建了模拟ACL腱骨止点结构的PLLA支架，通过亲和多肽以及Runx2基因控释，为干细胞构建生长微环境。利用支架结合干细胞与自体肌腱移植物构成复合体重建ACL，探讨该功能支架对干细胞募集与增殖及成骨细胞分化能力的影响及机制，并最终促进局部成骨、腱骨止点的愈合，增强重建韧带生物力学强度。本课题的完成为促进ACL重建后移植物腱骨愈合和止点形成的临床研究提供实验依据与基础。