成骨分化后的去分化BMSCs移植对前交叉韧带重建腱-骨愈合的促进作用及机制

Transplatation of bone marrow stem cells(BMSCs) could promote the tendon-bone healing after anterior cruciate ligament(ACL) reconstruction, but the insufficient proliferation and differentiation of BMSCs is still an obivous problem. Althouth gene transfection can partly improve this phenomenon, the biology technique is complex and the biosafty is a hidden peril. Recent research observed that BMSCs could be reverted to a primitive stem cell population (dedifferentiated osteogenic BMSCs, De-Os-BMSCs) with improved cell survival, colony formation, osteogenic potential, but there is no study about its osteogenic effect in vivo. We have previously confirmed that the expression of osteogenic growth factor in De-Os-BMSCs was obviously increased and the osteogenic potential is significantly enhanced. Based on literature and our own data, we hypothesized that transplatation of De-Os-BMSCs could effectively promote the tendon-bone healing after ACL reconstrction. The present project plan to explore the most ideal dedifferentiation condition for osteogenic differentiation of De-Os-BMSCs, clarify the promotive effect of transplantation of De-Os-BMSCs after ACL reconstruction, and verify the mechanism which is the activation of Nanog/NFATc1/Osterix pathway mediated the obvious enhancement of osteogenic differentiation. This project will contribute to provide a simple, high biosafty and easily clinical transitted method for promotion of tendon-bone healing after ACL reconstruction. This study has not been reported previously.

骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植促进前交叉韧带（ACL）重建腱-骨愈合时，其增殖分化效率不足的问题虽可用基因转染等方法部分解决，但技术复杂、生物安全性存隐患。最新研究观察到，成骨分化后的去分化干细胞再次成骨诱导具有显著增强的增殖及成骨能力，但未见其在体促进成骨的报道。我们前期也发现，这种去分化BMSCs细胞内促成骨因子表达增多、成骨效应显著增强。可以预测：去分化的BMSCs移植有望较常规BMSCs显著有效地促进ACL重建的腱-骨愈合。本研究拟从细胞水平探索最佳的利于BMSCs最终成骨分化的去分化条件；于整体水平从多方面证实去分化的BMSCs移植对腱-骨愈合的促进作用；印证Nanog/NFATc1/Osterix通路激活系其成骨效应增强的机制这一综合预试与文献提出的假说。本项目有望为促进ACL重建腱-骨愈合提供简便有效、生物安全性高、更容易过度到临床的方法。本研究思路与内容国内外未见报道。

腱-骨愈合是决定韧带重建效果的重要因素，骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植促进前交叉韧带(ACL)重建腱-骨愈合时存在增殖分化效率不足等问题。研究表明，成骨分化后的去分化干细胞再次成骨诱导具有显著增强的增殖及成骨能力，但其分子机制不明，且未见其在体促进成骨的报道。本项目通过建立体外兔BMSCs成骨分化模型，检测不同去分化条件下BMSCs成骨分化效应，探索利于去分化 BMSCs成骨效应最佳的去分化条件。建立兔自体半腱肌腱ACL重建模型，在腱-骨界面移植去分化BMSCs，检测ACL重建术后腱-骨界面影像学、组织学以及生物力学性能，同时检测腱-骨界面组织中成骨标志基因表达，评估腱-骨界面骨形成情况，证实去分化BMSCs移植对腱-骨界面骨形成的促进作用，且其促进作用优于原始BMSCs移植。进一步在体外BMSCs成骨分化系统中，通过Si-RNA干扰等方法证实成骨分化后的去分化BMSCs成骨效应增强的分子机制，并在动物模型上进行验证。研究结果发现，去分化3天的BMSCs再次成骨诱导分化后成骨标志基因COL1A1、OCN、OPN和Osterix的mRNA表达较去分化0天、7天和10天的BMSCs明显增加，COL1A1、OCN、OPN和Osterix的蛋白表达亦具有相同的表达趋势，提示去分化3天的BMSCs再次成骨分化效应最佳。取ACL重建术后的膝关节标本检测，HE染色表明，去分化BMSCs移植后可见腱骨界面明显的成熟骨组织与骨道骨组织移行连接；免疫组化显示去分化BMSCs移植后可见腱骨界面COL1A1、OCN和OPN等成骨标志基因的表达明显增加；Micro-CT扫描显示去分化移植后腱骨界面BV/TV值明显升高，腱-骨界面的骨组织形成显著增加；生物力学分析表明，去分化移植后重建ACL的最大负荷和平均刚度均明显升高。分子机制检测表明，成骨分化后的去分化BMSCs中， Nanog、NFATc1与Osterix的表达明显增加；再次成骨诱导分化时，NFATc1与Osterix结合增加并促进Osterix的表达，进而使成骨标志基因COL1A1、OCN和OPN的表达增加，显著增强其成骨分化效应；在ACL重建动物模型上亦发现腱骨界面Nanog/NFATc1/Osterix通路表达明显增加。本研究有助于提高ACL重建的术后疗效，降低因腱-骨愈合不良所致的手术失败率。