多位点酶微反应器结合高效毛细管电泳技术用于醉马草中抗肿瘤活性成分的高通量筛选研究

Screening of proteinase inhibitors from natural plants is a potent tool for developing new molecular targeted anti-tumor drugs. However, it is an arduous task to expand the screening throughput and speed, reduce the active component of missed diagnosis rate, and discover comprehensively the active substances in medicinal materials. This study aims at exploring and developing a new and universal approach to the screening of protinase inhibitors from medicinal plant efficiently by means of modern scientific technology..Epidermal growth factor receptor (EGFR), histone acetyltransferase (HDAC) and golgi alpha-mannosidase II (GMⅡ) are chosen as model target molecules. These kinds of enzymes are fabricated independently on the inner of capillary by physical or chemical modification, and an addressable and bioactive multi-site enzymes micro-reactor are thus prepared. Using the selective fishing hook of multiple enzymes in reactor, the effective components that can inhibit the corresponding enzyme activity of the plant material will be captured. For this purpose, we deem to develop an on-line drug screening method based on the multi-site enzymes micro-reactor coupled with the high performance capillary electrophoresis. Achantherum inebrians, a traditional Chinese anti-cancer medicines, is chosen as the medical plants source in this study. Afterwards, the research on screening anti-tumor active substances from Achantherum inebrians will be systemically investigated. .This novel platform is expected to be a rapid, robust and comprehensive method of screening proteinase inhibtors from natural plants. Meanwhile, it may have promising ecological and economic value in future.

从天然植物中筛选小分子蛋白酶抑制剂对抗肿瘤药物研发具有重要意义。对于以靶点为导向的筛选模式，当前面临的一个突出挑战是如何提升其筛选通量和速度，降低不同类型活性成分的漏筛率、最大程度挖掘药材中的活性物质。本项目把EGFR、HDAC和GMⅡ 等3种常见与肿瘤相关的靶点酶作为靶标，分段分区构筑于毛细管柱内壁，制备一种具有良好生物活性的多位点酶微反应器。拟利用反应器中多种酶靶点特异性识别的选择钩钓功能，单位时间内可同时捕获药材中多种类型的活性成分来提升筛选方法的通量。同时结合高效毛细管电泳分离技术，开展从我国少数民族特色植物醉马草中快速筛选抗肿瘤活性成分的研究。本研究可建立一种全面筛选药材中与癌症相关的多种靶点酶抑制剂的新方法，为全面认识药材中不同成分在抗癌中的作用开辟新的可能。同时对于今后科学认识、合理开发我国特有民族药用植物资源，使其中的一些实现“变害为宝”，具有重要的生态和经济价值。

从天然植物中筛选蛋白酶抑制剂对抗肿瘤药物研发具有重要意义。药物筛选方法是药物研发的关键环节。本项目基于当前单酶靶点药物筛选模式通量和效率不足等缺陷，提出了多酶靶点取代单靶点的药物筛选模式。以表皮生长因子受体（EGFR）、组蛋白去乙酰化酶（HDAC6）和α-甘露糖苷酶（α-Man）作为靶标分子，分别采用分区段串联固定法和并行固定法两种方案，使他们实现在空间上的独立固定。先后发展建立了毛细管电泳多位点酶微反应器和基于表面等离子体共振的酶生物芯片技术。基于多靶标酶固定化→样品相互作用→活性成分特异性识别→样品分离→活性检测的一体化筛选平台策略，来提高筛选通量。利用所构建方法，以我国民族地区特色有毒药材醉马草为模型药材，开展了酶抑制剂活性成分的筛选研究。.通过研究，利用毛细管电泳多位点酶微反应器在线筛选技术发现并验证了醉马草中存在含α-Man抑制剂的活性成分。在此基础上利用基于SPR技术的酶生物芯片耦合高效分离技术，开展了从醉马草中定向筛选酶抑制剂工作。先后分离制备得到19种单体，其中10种为醉马草中首次分离得到，3种化合物与α-Man具有强的亲和力。细胞实验表明筛选的鸭嘴花酮碱和脱氧鸭嘴花酮碱对人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF7、人肺癌细胞株HCC827均具有较强的抑制活性。特别是对于HCC827，脱氧鸭嘴花酮碱比阳性对照苦马豆素具有更强的抑制力。Western Blot和real-time PCR检测显示，鸭嘴花酮碱和脱氧鸭嘴花酮碱可能通过下调细胞中的α-高尔基体甘露糖苷酶（α-GMII）、HDAC6、EGFR和p-EGFR蛋白的表达和上调E-cahderin的表达抑制了肿瘤细胞的增殖和转移。揭示它们具有多酶靶标抑制性能的特点。.本项目以生物分子靶点特异性捕捉和高效分离技术相结合的筛选思维为基点，设计制备具有多靶点同时作用的固定化多酶为识别元件，结合高效分离技术，从成分复杂的植物药材中定向性筛选活性成分，具有目标性强、选择性好、时间短、效率高等优点，大大加快了药物的筛选周期。为全面认识药材中不同成分在抗癌中的作用开辟新的可能。相关研究成果发表学术论文6篇，其中SCI收录1篇，北大核心期刊4篇；申请国家发明专利1项；参加国内本领域专业学术会议3次，作分会学术报告作分会学术报告1次；培养硕士研究生3名。