基于"FACS-酶微反应器"的超高通量酶筛选系统

酶定向进化技术通过在实验室中模拟自然进化过程，从海量突变库中筛选功能发生重要改进的突变体，对于阐明蛋白质分子进化历程、构建新功能酶等具有重要意义，但限制其广泛应用的技术瓶颈之一是仍缺少有效的普适性超高通量筛选方法。在前期研究工作中，我们已成功地建立了对特定酶系统的荧光激活细胞分选（FACS）超高通量筛选技术。为提高该系统通用性，以利于多种酶系突变库的筛选，本项目以脂肪酶随机突变库为模式系统，拟用微流控芯片制备体积高度均一的体外区室化（in vitro compartmentalization，IVC）酶微反应器，形成宿主细胞-酶活性-产物荧光信号的偶联，进而应用FACS系统筛选获得高稳定性和高催化活性的突变体。本项目所建立的通用型超高通量酶活性筛选技术，将完善酶定向进化技术体系，推动酶学理论和相关生物催化高技术的发展。

酶定向进化技术通过在实验室中模拟自然进化过程，从海量突变库中筛选功能发生重要改进的突变体，对于阐明蛋白质分子进化历程、构建新功能酶等关键科学问题的解决均具有重要意义，但限制其广泛应用的技术瓶颈之一是仍缺少有效的普适性高通量筛选方法。在本研究中，我们建立了基于体外区室化-荧光激活细胞分选（IVC-FACS）的通用型酶活性超高通量筛选方法，通过创造皮升级体积的“酶微反应器”，并利用流式细胞仪高速、可定量分析的特点对酶活性进行高速检测和分选。本研究注重多学科交叉，通过药剂学、微流控芯片、合成化学等多学科交叉技术的应用，优化了“水-油-水”二级微液滴的均一性和荧光信号的稳定性，从而极大地改善了IVC-FACS体系的灵敏度和准确度。应用该筛选体系，我们成功地对酯酶进行了定向进化，筛选获得了催化活性显著改善的突变体，显示了该技术在酶活性筛选中的广阔应用潜力。. 本研究主要获得的创新性成果有：. （1） 开发了利用膜挤出法制备“水-油-水”二级微液滴的技术，相比于常规的匀浆仪乳化法获得的微液滴均一度明显提高。基于该液滴制备的酶微反应器具有良好的灵敏度和宽泛的动力学范围，能准确分辨两倍以下的酶活性差别，且酶动力学表现与大体积反应基本一致。将该体系进一步应用于酯酶AFEST的定向进化，经过一轮筛选即从200万株突变体中获得了催化效率提高2倍以上的突变体，其催化效率已接近分子扩散的速度极限。.（2）开发了基于微流控芯片技术，制备高度均一的“水-油-水”二级微液滴的方法，大大简化了两步法生成微流控二级微液滴的操作，生成的微液滴单分散性极高，使得液滴荧光反应的数据准确性可与传统的孔板法相媲美。.（3）开发了基于微流控芯片的在线双色监测分选体系，采用“水-油”一级微液滴作为酶微反应器，在微流控芯片上集成液流、检测、分选装置，可以同时检测两种荧光信号，适合于对酶进行立体选择性、区位选择性等双底物筛选。.（4）建立了荧光底物设计的“荧光液滴捕获(FDE)”原理。通过控制分子亲水性和疏水性的平衡，以磷酸三脂酶为模型设计合成了适用于微反应器筛选的新型荧光底物，可有效提高分选准确度及降低荧光背景干扰，一轮筛选的富集效率即可达900倍以上。