PTP1B纳米微反应器-毛细管电泳在线筛选河南道地药材降血糖活性成分研究

Protein tyrosine phosphatase-1B ( PTP1B ) plays an important role in cell transmission, and it is an important target for treatment of type Ⅱ diabetes. So finding safe and effective PTP1B inhibitors is one key facor to the study of diabetes mellitus drugs. The rapid screening of active ingredients in complex system of traditional Chinese medicine is a hot and difficult research topic for traditional Chinese medicine. Based on our previous work on separation of active components in Henan genuine medicinal materials, and the interaction of drug molecules with proteins/enzymes researches, this project intends to screen PTP1B inhibitors from Henan authentic ingredients with capillary electrophoresis online PTP1B micro-reactor using functionalized magnetic nanoparticles or precious metal nanoparticles modified titanium dioxide nanotubes as a carrier, immobilizing diabetes target molecule-PTP1B. The PTP1B micro-reactor is online combined with capillary through the magnetic field force built outside the capillary or the ion interaction between nanoparticles functioned PTP1B and modified capillary inner wall. A new online screening model which can integrate online screening, isolation, identification for PTP1B inhibitors will be established and used to screen active hypoglycemic ingredients from Henan genuine medicinal materials. Meanwhile, modern spectral and chemical methods will be used to identify the new structure of the inhibitors. Natural and efficient PTP1B inhibitors will be selected, using the classic vanadate as a comparison. The results will provide references for future hypoglycemic drugs design and synthesis and also provide an opportunity for comprehensive integrated exploitation and utilization of Henan authentic crude drugs.

蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)在细胞传导中起重要作用，是治疗Ⅱ型糖尿病的重要靶点，因此寻找安全有效的PTP1B抑制剂是抗糖尿病药物研究的关键之一。中药复杂体系中活性成分快速筛选是中药研究的热点和难点问题。本课题根据前期分离河南道地药材活性组分，药物活性分子与蛋白质/酶相互作用研究领域积累的经验，以河南道地药材为研究对象，利用功能化的磁性纳米粒子或修饰的二氧化钛纳米管作为载体，固定PTP1B，利用毛细管电泳，通过外加磁场或与管内壁相互作用等方式，制备毛细管电泳柱端PTP1B纳米微反应器，建立新的集在线筛选、分离、鉴定于一体PTP1B抑制剂高通量筛选模型，对河南道地药材降血糖活性成分进行筛选。利用现代光谱方法与化学方法对抑制剂结构进行鉴定，以期发现新型PTP1B抑制剂，为找寻和开发抗糖尿病新药奠定基础，同时也为河南道地药材的综合开发利用提供契机。

本项目通过水热法合成了尺寸均匀、具有良好的磁响应度和分散性的Fe3O4纳米颗粒及氨基化的Fe3O4@rGO纳米复合材料。以戊二醛作为化学交联剂，将α-葡萄糖苷酶固定在载体材料上，制备酶微反应器，并结合色谱/质谱技术建立了怀山药中降血糖活性成分的离线筛选模型，选择性筛选出二种活性成分（2,4-二甲氧基-6,7-二羟基菲、山药素 Ⅰ）。在室温下合成了一种十二面体的多孔材料（ZIF-90），并将其用作载体来构建固定化酶微反应器。将微量进样器、固定化酶微反应器与高效液相色谱在线联用，构建简易的在线筛选系统，并应用于河南道地药材-山药皮、忍冬叶、熟地黄中α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选。从山药皮提取液中筛选出了三种α-葡萄糖苷酶抑制剂（2,4-二甲氧基-6,7-二羟基菲、山药素 I、3,5-二甲氧基-2'-羟基联苄）。从忍冬叶粗提物中筛选出的三种化合物分别为异绿原酸B、1，5-二咖啡酰奎宁酸和异绿原酸C。此外，还从熟地黄正丁醇相中筛选出了三种未知结构活性成分。该在线筛选系统中的固定化酶微反应器可以方便地更换，筛选流速和洗脱时间可通过微量进样泵轻松调节和控制，可以快速实时捕获中草药α-葡萄糖苷酶抑制剂。合成了磁性Fe3O4@ZIF-67，然后将其作为固定α-葡萄糖苷酶的载体，利用外加磁场构建磁性固定化酶微反应器，并与HPLC联用，构成了集筛选、洗脱、分析于一体的磁在线抑制剂筛选装置，并应用于信阳毛尖茶中降血糖活性成分的在线筛选，儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素酸酯三个化合物被筛选出来。项目研究中所建立的筛选方法可以简便、高效地从天然产物资源中筛选潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂，有望应用于其它的生物酶，以筛选天产物中活性成分，为加快新药的研发提供有效地依据。此外，根据山药筛选结果，合成制备了几个降血糖活性较好的菲类化合物，通过开展酶抑制研究、动力学以及光谱学实验，研究了这些菲类化合物与α-葡萄糖苷酶的相互作用。结果显示这三个化合物对α-葡萄糖苷酶均有良好的抑制作用，IC50值均远低于阳性对照阿卡波糖的IC50。并对抑制类型和抑制机理进行了考察，证明项目研究中所建立的纳米微反应器及其筛选模型切实可行，可用于河南道地药材降血糖活性成分筛选。本项目的开展及所取得的研究成果不仅为今后的降血糖药物设计合成提供参考，同时有助于开发新的天然降血糖药物，也为河南道地药材的现代化发展提供科学依据。