牛MyoD1启动子调控目的基因靶向转录机制的研究

MyoD gene families that include MyoD1, MyoG, Myf5 and Myf6 have important significance for the generation of muscle and animal growth. While MyoD1 plays the role of master switch in the process of transcription and activation of the specific genes, and participates in the growth, development and repair of skeletal muscle. Previously, our research group studied the expression profile of MyoD1 gene in cattle tissues, screened and identified the start activity of MyoD1 promoter and the related transcription factors, and also explored the tissue specificity of MyoD1 promoter in terms of cellular and molecular levels. On the basis of previous work, the differential genes caused by the deficiency and over-expression of MyoD1 promoter were identified in bovine myoblasts to screen the MyoD1 regulated genes. Moreover, the expression difference of MyoD1 regulated genes in the normal and over-expressed bovine myoblasts was also investigated. Furthermore, the growth of mice transferred by the MyoD1 regulated genes was observed to clarify the effectiveness and specificity of MyoD1 promoter. These obtained results will promote the understanding of the molecular mechanism of gene targeting transcription regulated by MyoD1 promoter.

MyoD 基因家族包括MyoD1、MyoG、Myf5和Myf6，对肌肉的产生和动物生长具有重要意义，而MyoD1在骨骼肌特异性基因的激活与转录过程中起着总开关的作用，并参与骨骼肌生长、发育和修复。本课题组前期研究了MyoD1在牛各组织中的表达谱，筛选和鉴定了MyoD1启动子区及其相关转录因子，并从细胞和分子水平探讨了MyoD1启动子的组织特异性。在前期研究工作基础上，本课题拟进一步研究在牛成肌细胞中，MyoD1启动子过表达前后细胞中的差异基因，筛选牛MyoD1启动子调控的目的基因；研究筛选的目的基因在牛成肌细胞及过表达细胞中的表达差异，验证牛MyoD1-目的基因转入小鼠后对其生长的影响，弄清MyoD1启动子调控目的基因的有效性和特异性，解析牛MyoD1启动子调控目的基因靶向转录的分子机制。

MyoD I(MyoGenic differentiation I)基因是成肌调节因子(Myogenic regulatory factors，MRFs)家族的成员之一，于1987年被首次克隆，该基因是骨骼肌生长发育过程中重要的正调控基因。现已知牛的MyoD I位于15号染色体，总长度2648 bp，有3个外显子。MyoD I基因在肌肉特异基因转录调控过程中起总开关作用，与肌球蛋白、结蛋白、肌细胞生成素等基因的启动子区结合可发挥调控作用，促使它们转录作用的激活。启动子作为基因表达调控的重要元件，对实现外源基因在转基因生物中的高效表达具有重要意义。. 本试验以关岭牛的MyoDI基因为研究对象，开展了MyoD I基因启动子靶向转录目的基因的有效性和特异性以及MyoD I基因启动子的活性及功能的研究。研究结果如下：. 1.通过构建MyoD1慢病毒过表达载体，筛选获得了MyoD1基因过表达稳定细胞系。采用MAS软件绘制MYOD1基因的蛋白质网络图，分析了MYOD1基因主要参与的生物过程和发挥的分子功能。. 2.探究关岭牛4个不同长度的MyoD I启动子的启动活性，初步确定该基因活性较强启动子位置。筛选出关岭牛MyoD1基因启动子区含有MyoD、VDR、MEF1、MEF2、SF1和Myf6转录因子结合位点。成功克隆关岭牛MyoD家族的CDS区，构建重组克隆载体pcDNA3.1(+)-MyoD、pcDNA3.1(+)-MyoG、.pcDNA3.1(+)-Myf5、pcDNA3.1(+)-Myf6、PGL3-P1-MEF1和PGL3-P2-MEF1。重组质粒的共转染结果显示，外源过表达转录因子MyoD、Myf5、Myf6均能显著提高关岭牛MyoD1基因启动子全长P1的转录活性(P＜0.05)。. 3.MyoDI基因在关岭牛不同组织表达量的差异及在肌肉发育过程中表达情况的研究。结果显示：MyoD I基因在背最长肌中表达量最高；在出生后的关岭牛肌肉组织中也具有比较高的表达量，且随着出生时间的推移呈上升趋势。推测可能由于背最长肌是肌肉富集地方因此基因表达量较高，随着年龄增大，肌肉丰满度增加，基因表达量也随着增加。通过原核显微注射的方法获得发绿色荧光的转基因小鼠，为调控元件及基因的功能验证奠定基础。