鱼糜凝胶形成过程中外源半胱氨酸蛋白酶抑制剂的作用机制研究

The degradation of myofibrillar protein by endogenous cathepsin is the main reason for the deterioration of the quality of surimi gel. The addition of exogenous cysteine protease inhibitor (CPI) can effectively inhibit the protease activity, enhance the gel strength and improve the quality of surimi products. At present, animal serum protein used as CPI has the most promising application. Since its component complexity, it is of great significance to explain the types and mechanisms of the active components of CPI. In this study, the CPI purified from plasma proteins is firstly analyzed by affinity chromatography followed by mass spectrometry, circular dichroism, and nuclear magnetic resonance. Then the mechanism and kinetics of reaction between CPI and cathepsin are explained by the analysis of isothermal titration calorimeter (ITC), biolayer interferometry (BLI), and Lineweaver-Bunk plot. In addition, molecular docking, crystal structure analysis, and site-directed mutation by genetic engineering are investigated to reveal the active sites and structure-activity relationships between CPI and cathepsin, which will guide the further discovery of more active components and their purification and application. The related results will lay a theoretical basis for the rational application of exogenous protease inhibitors in surimi processing.

鱼糜加工过程中内源性组织蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解是导致鱼糜凝胶品质劣化的最主要原因，而外源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPI）的加入能够有效抑制蛋白酶活性、增强凝胶强度、提高鱼糜制品品质。目前最具应用前景的是动物血清蛋白，但是其成分复杂，阐述其中CPI有效成分的种类及其作用机制具有重要意义。本项目以动物血清为研究对象，首先对其中的CPI有效成分进行分离纯化，通过Q-TOF-质谱分析进行氨基酸序列鉴定；进而利用圆二色谱、核磁共振等手段对外源蛋白酶抑制剂分子结构进行解析；利用等温滴定量热、分子膜层干涉、Lineweaver-Bunk双倒数分析等手段对CPI的作用规律和反应动力学进行阐述；进一步地通过分子对接、定点突变等手段对CPI与蛋白酶相互作用的活性中心、关键位点及氨基酸进行阐述，对蛋白酶抑制剂的作用位点、构效关系进行深入研究。相关结果将为外源CPI在鱼糜加工中的合理化应用奠定理论基础

鱼糜加工过程中内源性组织蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解是导致鱼糜凝胶品质劣化的最主要原因，而外源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPI）的加入能够有效抑制蛋白酶活性、增强凝胶强度、提高鱼糜制品品质。目前最具应用前景的是动物血清蛋白，但是其成分复杂，阐述其中CPI有效成分的种类及其作用机制具有重要意义。因此本项目从外源半胱氨酸蛋白酶抑制剂入手，对其抑制过程中热力学变化、抑制机理以及蛋白相互作弄机制进行研究，为减少凝胶劣化、提升鱼糜产品品质提供一定的理论参考。本项目首先以外源动物血清为研究对象，对其中的外源CPI有效成分进行获取。通过重组表达、盐析、弱阴离子交换柱层析、分子筛等手段得到具有明显抑制活性的外源CPI，进而通过Q-TOF-质谱分析进行氨基酸序列鉴定；其次利用等温滴定量热分析、Lineweaver-Bunk双倒数分析等手段对CPI的作用规律和反应动力学进行阐述明确外源CPI发挥作用的化学反应过程；进而利用圆二色谱、红外光谱等手段对外源蛋白酶抑制剂分子与酶相互作用过程中的结构变化进行解析；进一步地利用分子对接手段对CPI与蛋白酶相互作用的活性中心、关键位点及氨基酸进行阐述，对蛋白酶抑制剂的作用位点、构效关系进行深入研究；最后对血浆酶解物蛋白肽类外源CPI进行酶解法制备，并通过弱阴离子交换层析、质谱鉴定等手段对其中发挥重要作用的组分进行分离，对其氨基酸序列进行鉴定，并利用分子对接等方法对其发挥的蛋白酶抑制活性进行机制研究。相关结果将为外源CPI在鱼糜加工中的合理化应用奠定理论基础。