猪伪狂犬病病毒microRNA的鉴定及其调控机制的探讨

最新研究证实疱疹病毒miRNA在病毒的生物学过程中调控70%的基因功能，揭示了miRNA是一种新的重要调节机制，miRNA能够参与调控病毒的复制、潜伏、致病性等。PRV是猪的主要病原微生物之一，该病毒的miRNA可能在病毒致病及潜伏中发挥关键作用。本课题拟在系统分析PRV基因组中非编码区域和基因间隔区的基础上，利用miRNA噬菌体文库技术和病毒非编码区杂交探针，筛选鉴定PRVmiRNA编码基因。定位分析PRVmiRNA编码基因，构建病毒重组质粒和病毒同源重组系统，获得miRNA基因簇及单基因簇敲除的PRV毒株，建立Balb/c实验动物模型，研究miRNA基因簇内敲除对PRV致病性及潜伏性的调控影响，最终鉴定调控PRV致病、潜伏表型的miRNA。PRV能够终生潜伏于猪的体内，是该病毒的保藏宿主，研究其编码miRNA的功能，为阐明该病毒的致病性、潜伏性及免疫逃避机制奠定基础。

最新研究证实疱疹病毒miRNA在病毒的生物学过程中调控70%的基因功能，miRNA的调节是一种新的重要调节机制，由于伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科的成员之一，因此伪狂犬病毒编码的miRNA可能在病毒潜伏与激活过程中发挥着重要作用，然而关于PRV miRNA 的调节机制以及其在基因组中的位点，目前仍然是个未知数。猪是PRV的保藏宿主，且能够终生潜伏于猪的体内，并造成养猪业严重的经济损失。PRVmiRNA的位点及功能鉴定，为阐明该病毒的致病性、潜伏及免疫逃避机制及疫病控制具有指导意义。.本研究利用PK-15细胞培养猪伪狂犬病毒，接毒后在不同时间阶段收集病毒细胞培养物，分别提取不同时间段细胞培养物的总RNA；变性聚丙乙烯酰胺凝胶分离出18-26nt的小片段RNA，小RNA分子两端先后连接生物接头后进行反转录，PCR扩增后回收DNA片段；将所获得DNA片段与质粒载体连接，将连接产物转化工程菌，成功构建了猪伪狂犬病病毒小RNA的cDNA文库，同时又构建了病毒非编码DNA文库。首先利用生物信息学预测软件，系统分析PRV基因组中非编码区域，并获得PRVmiRNA；同时利用高通量测序系统测量分析不同时段PRV PK15细胞培养物的小RNA文库，在18-24nt区域共获得1678306个读数，其中约1132288读数与PK15基因组序列匹配，6012读数与PRV基因组序列匹配；对测序结果采用计算机软件分析法和实验法相结合的方式鉴定miRNA，高通量测序分析发现17个miRNA，茎环RT-PCR和northern blot 鉴定证实了10个miRNA，多数miRNA位于潜伏转录区的内涵子中。通过Balb/c动物模型及基因缺失毒株，鉴别miRNA的调节功能，结果显示PRV在宿主细胞内潜伏状态的建立与miRNA的调节相关。