猪miR-21介导靶基因调控伪狂犬病毒感染的作用机制研究

The infectious disease is the greatest threat to today's pig industry. PRV (Pseudorabies virus, herpes virus family) is one of the most susceptible pathogen of pigs, which causes Pseudorabies with fast spread and high piglet mortality. It is not sufficient understanding about PRV infection of the host and the immune regulatory mechanism. Preliminary study on PRV infection of PK15 cells showed the results that miR-21 expressed significantly up-regulated after infection, and its target gene IP10 can inhibit PRV proliferation. In this study, miR-21 transcription factors and the novel target genes (STAT3、MAPK10、MAP2K及MAP3K) which are related to pathways of the JAK/STAT, the MAPK and PI3K/Akt will be identified, and their role of PRV proliferation in the host will be studied. The result may reveal the molecular mechanism of miR-21 up-regulation caused by PRV infection, and can provide clues to reveal the mechanism of miR-21 mediated target genes regulate PRV infection. It can also provide new ideas to study the molecular mechanism of herpes virus infection and novel materials for the excavation of candidate genes for pig disease resistant breeding.

猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV，疱疹病毒科）感染引起伪狂犬疾病传播快、仔猪死亡率高，是猪群易感的几个主要病原之一，但现有研究仍不能阐明PRV感染的分子机理及引起宿主的免疫调节机制。申请人前期在PRV感染PK15细胞microRNA表达芯片中发现猪miR-21显著上调，且其介导的靶基因IP10对PRV增殖具有抑制作用。本研究拟通过预测和EMSA方法鉴定PRV感染后调控miR-21表达的转录因子，鉴定miR-21介导的参与PRV感染相关通路JAK/STAT、MAPK和PI3K/AKT靶基因，通过miR-21/靶基因的超表达和抑制表达研究miR-21介导靶基因调控伪狂犬病毒感染宿主的分子机制，结果可为揭示PRV感染引起miR-21上调表达的分子机制打下基础，可提供疱疹病毒感染宿主分子机制研究的模型，猪抗病育种候选基因/miRNAs发掘的新思路

各种病原引起的传染性疾病给现代养猪生产造成了巨大损失，本研究应用在猪生产中传染性强、死亡率高、危害大的伪狂犬病毒为模型，利用microRNA芯片技术，用伪狂犬病毒（PRV）感染PK15细胞并进行microRNA芯片杂交，筛选得到持续上调表达的miR-21，并通过QPCR得到验证；利用生物信息学预测及stem-loop RT-PCR方法克隆了miR-21。探索其对病毒复制的影响及对宿主基因的调控作用，期望鉴定新的抗病候选miRNA和基因，为抗病育种工作提供有力的素材。获得了如下的研究结果：（1）以小鼠肝癌细胞Hepa1-6为模型，通过双荧光素酶报告基因实验结合ELISA方法验证了Cxcl10是miR-21的靶基因。PolyI:C刺激小鼠巨噬细胞后，CXCL10基因mRNA先上调表达，4h后迅速下调，而miR-21表达水平持续上调，推测miR-21可能对CXCL10基因的mRNA水平存在负调控作用；（2）通过绝对定量PCR和免疫荧光检测发现过表达猪CXCL10基因的PK15细胞中PRV病毒在核酸水平和蛋白水平均显著低于对照组；（3）利用PCR-RFLP方法鉴定了猪CXCL10基因3’UTR存在C/T突变的SNP位点，与免疫性状关联分析结果表明该SNP位点与20日龄淋巴细胞百分数（LY%），80日龄红细胞压积（HCT）、平均红细胞容积（MCV）、红细胞平均血红蛋白含量（MCH）及80日龄血红蛋白含量（HGB）存在显著相关；（4）试验结果显示STAT3、MAPK10、MAP2K和MAP3K不是miR-21的靶基因；（5）本项目发表SCI收录论文2篇，申报国家发明专利1项，预计项目结束2年内还有1-2篇论文可能发表。