基于内质网应激-自噬反应研究“脾主肌肉”理论下推拿脾经治疗骨骼肌损伤的作用机制

The theory of "spleen master muscle" is one of the core treatment theories of hamstring injury.And our team has applied massage of spleen meridian to treat sports injury for a long time,which has a significant clinical effect. Previous studies showed that massage of spleen meridian could reduce the expression of TNF-a in rats with blunt injury of gastriculus muscle and promote the repair of muscle injury. According to extensive research ,TNF-a can activate endoplasmic reticulum stress response and induce autophagy.And Endoplasmic reticulum stress - autophagy is the key to repair skeletal muscle injury.Therefore, A hypothesis is proposed that massage of spleen meridian can regulate endoplasmic reticulum stress-autophagy response by down-regulating TNF-a expression in the treatment of skeletal muscle injury.So in this project,we intends to use the model of blunt injury of gastrocnemius muscle in rats as research object and to treat with massage of spleen meridian under the guidance of the theory of “Splenic primary muscle”.Using ELISA, WesternBlot, Immunoelectron microscopy, Immunofluorescence and Laser confocal scanning to observe TNF-a,Calcium ion, calmodulin (SERCA, PDI), endoplasmic reticulum stress protein (CRT, GRP78) and CRT localization in autophagosome, localization and quantification of FMA134B and LC3.To explore the mechanism of massage of spleen meridian in the treatment of skeletal muscle injury and lay a foundation for clinical application.

“脾主肌肉”是筋伤骨病的核心理论之一，本团队长期应用推拿脾经治疗骨骼肌损伤，疗效显著。前期研究表明推拿脾经能降低腓肠肌钝挫伤大鼠TNF-a表达，促进肌肉修复。最新研究表明TNF-a可激活细胞内质网应激反应，诱导自噬，且内质网应激-自噬是骨骼肌损伤修复的关键，因此我们提出推拿脾经通过下调TNF-a表达调控内质网应激-自噬反应治疗骨骼肌损伤的假说。本项目拟以大鼠腓肠肌钝挫伤模型为研究对象，在“脾主肌肉”理论指导下，釆用推拿脾经治疗，运用WesternBlot、免疫电镜、免疫荧光、激光共聚焦扫描等技术，观察推拿脾经对TNF-a，骨骼肌内质网应激（钙离子、钙网蛋白酶、内质网应激蛋白），内质网自噬反应（自噬受体蛋白FMA134B、自噬标志性蛋白LC3）及应激蛋白与自噬蛋白相互作用（FMA134B与CRT、CRT与LC3表达量及共定位）的影响。探讨推拿脾经治疗骨骼肌损伤的作用机制，为临床应用奠定基础。

前期研究表明推拿脾经能降低腓肠肌钝挫伤大鼠TNF-a表达，促进肌肉修复。最新研究表明TNF-a可激活细胞内质网应激反应，诱导自噬，且内质网应激-自噬是骨骼肌损伤修复的关键，因此我们从内质网应激-自噬反应，探讨“脾主肌肉”理论下推拿脾经治疗骨骼肌损伤的作用机制。研究结果表明：1.以 170 g重物，70 cm 高度，以底部直径0.5 cm弹簧缓冲聚合式打击头部，连打5次，可对大鼠骨骼肌造成中度损伤，其自然恢复时间至少14 d，该造模方式可以有效建立起大鼠骨骼肌钝挫伤模型。通过CatWalk 步态参数、HE染色、超微结构及TNF-α表达来验证模型是否成功，关键数据如下：①CatWalk 步态参数：与空白组相比，模型组的平均速度与最大速度变化率均明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.001）；与健康侧肢体组相比：受伤侧肢体组肢体的最大接触面积、足印面积和站立相持续时间均明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。②HE染色：观察到3d后大量炎症细胞浸润，肌纤维大量溶解坏死，14d 尽管瘢痕组织仍然存在，但HE染色上的组织修复与空白组几乎没有区别。③超微结构：打击后0h部分肌浆网出现空泡现象，3d肌纤维和部分肌浆网溶解，炎症反应加重，到14d 基本恢复正常。④TNF-α表达水平: 0h 开始至12h 这段时间内，TNF-α含量即开始逐渐升高达到高峰，并在损伤后 12h至72h 一直保持较高水平，与空白组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)，到14d基本恢复正常水平。2.推拿脾经可能通过促进自噬，减少内质网应激，从而减低炎症、维持细胞内稳态，减少细胞凋亡来促进骨骼肌钝挫伤后的修复。关键数据如下：推拿脾经可降低炎症因子TNF-α，IL-6的表达（P＜0.01）；推拿脾经可调节钙酶功能SERCA 、PDI (P＜0.05，P＜0.01)，从而维持细胞内钙稳定，并减少骨骼肌细胞凋亡；推拿脾经可减低内质网应激蛋白GRP78、CRT 的表达(P＜0.05，P＜0.01)；推拿脾经可提高FAM134b、LC3的表达及促进其共定位表达(P＜0.05，P＜0.01)。因此推拿脾经治疗骨骼肌钝挫伤可能是通过促进自噬，从而减少内质网应激而起效。