特异溶瘤腺病毒干预NKG2D信号治疗前列腺癌的实验研究

Currently there is a lack of effective treatments for metastasized or hormone resistant prostate cancer. Immune therapy may be one of best choices for treatment of these diseases. As an important target of tumor immune therapy, natural killer (NK) cells can not only exert direct cytotoxic functions, but also induce CD4+ helper cell-independent CTL responses. High expression of a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10/17 on prostate cancer cells mediated the production of souble Natural killer group 2 D (NKG2D) ligand. Prostate cancer cells can also secret transforming growth factor-β(TGF-β), which could downregulate the NKG2DL expression on NK cells. The downregulation of NKG2DL and NKG2D can infulence NK activation by intervention of NKG2D-NKG2DL singal. In this study, we will inhibit ADAM10/17 and TGF-β expression simultaneously by using oncolytic adenovirus carrying dual specific shRNA. The specific oncolytic ability and mechanism of immune activation of NK cells, dendritic cells and T lymphocytes will be evaluated in vitro. Mouse-derived prostate cancer cells were implanted to normal or NK defective C57 mice to establish prostate cancer burdened mice model. Furthermore,oncolytic adenovirus will be injected into tumor to evaluate the therapeutic effect and immune response including activation of NK cells, T lymphocytes and DC. The synergistic effect for interference of ADAM10/17 and TGF-β will also be discussed. The results will provide a novel therapeutic strategy to treat prostate cancer more efficiently.

转移或激素非依赖型前列腺癌目前仍然缺乏有效治疗手段。免疫治疗可能是该类肿瘤晚期的最佳选择之一。NK细胞作为天然免疫的重要效应细胞和CD4+细胞非依赖性CTLs诱导的中心环节，是肿瘤免疫治疗的重要靶标。前列腺癌患者肿瘤细胞高表达的ADAM10/17可导致可溶性NKG2DL产生，而分泌的TGF-β则可下调NK细胞NKG2D受体，进而影响NKG2D信号和NK细胞的激活。本研究拟采用前列腺癌特异溶瘤腺病毒为载体，采用双shRNA干涉肿瘤细胞ADAM10/17和TGF-β的表达，研究其体外特异性溶瘤功能，NK细胞、DC、T淋巴细胞的免疫激活作用及机制；建立完全免疫系统和NK细胞功能缺失的荷瘤小鼠模型，评价体内溶瘤、免疫激活、抗肿瘤效应及机制，明确NK细胞在NKG2DL介导抗肿瘤免疫中的作用；探讨ADAM10/17干涉和TGF-β干涉的协同效应及机制。预期为前列腺癌免疫基因治疗提供新的、更有效的策略。

转移或激素非依赖型前列腺癌仍缺乏有效治疗手段，近年来，肿瘤免疫基因治疗的快速发展，为晚期肿瘤治疗带来了希望。NK细胞，不仅是天然免疫的重要效应细胞，也是CD4+T细胞非依赖型CTLs诱导的中心环节，因此，NK细胞是肿瘤免疫治疗的重要靶标。研究表明，前列腺癌细胞高表达的ADAM10/17可导致可溶性NKG2DL产生；同时，前列腺癌细胞分泌的TGF-β则可下调NK细胞NKG2D受体，进而影响NKG2D信号和NK细胞的激活。本课题采用前列腺癌特异性溶瘤腺病毒为载体，通过干预ADAM10/17介导的NKG2D-NKG2DL信号和TGF-β信号，评价其对肿瘤生长和转移的影响。取得的主要研究成果包括：（1）建立NK细胞体外培养体系和体外功能评价体系，并证实：增强NKG2D信号可促进小鼠NK细胞和T淋巴细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用。（2）在多种肿瘤模型中证实，阻断TGF-β信号可抑制肿瘤生长和转移：①携带sTGFβRII的溶瘤腺病毒(rAd.sT)可有效杀伤多种肿瘤细胞（前列腺癌、乳腺癌等）并表达目的基因；②在免疫完全小鼠模型中，rAd.sT可有效抑制肾癌和乳腺癌的生长，抑制肿瘤骨转移相关指标并激活机体抗肿瘤免疫反应。（3）成功制备可同时抑制NKG2D-NKG2DL信号和TGF-β信号的溶瘤腺病毒CRAD-sh-AT，并完成体外功能研究。（4）制备了lyp1修饰的肝脏低毒性溶瘤腺病毒，为肿瘤骨转移治疗提供了理想的载体系统。此外，我们还开展了联合免疫治疗，包括将rAd.sT与靶向Mesothelin的CART联合应用，其在乳腺癌模型中，可增强对局部肿瘤的抑制效应，并减少肝转移的发生。而在前列腺癌骨转移的机制研究方面，我们证实SENP1可通过TGFβ信号通路影响前列腺癌细胞的EMT和转移。综上所述，本课题明确了NKG2D-NKG2DL信号在淋巴细胞激活中的作用，明确了抑制TGF-β信号可有效抑制多种肿瘤的生长和转移；成功制备了ADAM10/17和TGF-β双干涉的溶瘤腺病毒CRAD-sh-AT，为最终的疗效评价打下基础。此外，肝脏低毒性溶瘤腺病毒的成功制备，为肿瘤骨转移提供了理想的载体系统；而前列腺癌骨转移的机制研究，为前列腺癌骨转移的治疗提供了新的靶标。