长链非编码RNA EPB41L4A-AS2抑制鼻咽癌侵袭转移的功能及机制研究

Invasion and distant metastasis are the main factors affecting the long-term survival of patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC). In the present study, We screened for a new lncRNA EPB41L4A-AS2 （EPB）which is significantly down-regulated in NPC tissues through gene microarray. Further study found that EPB was significantly down-regulated in NPC cells and tissues, over-expression of EPB significantly inhibited the invasion and migration of nasopharyngeal carcinoma cells. Bioinformatics and in vitro studies demonstrated that TGFBR1 was a potential down-stream target of EPB. Therefore, we further hypothesize that " EPB might down-regulate TGFBR1 through binding to EZH2, and inhibit NPC invasion and metastasis ". This proposal is designed to investigate the function of EPB through gene over-expression / silence strategy, and cell proliferation、invasion and metastasis assay. Using TGFBR1 as a mechanism clue, we will further investigate biological characteristics and regulatory mechanism of EPB via RIP, CHIP, and resecue experiments. To date, no data is available about EPB inhibit the invasion and migration of NPC at home or abroad, This study will provide new therapeutic targets for the prevention and treatment of NPC.

侵袭转移是影响鼻咽癌患者长期生存的重要因素。我们前期通过lncRNA芯片筛选，发现lncRNA EPB41L4A-AS2（简称EPB）差异低表达于有转移鼻咽癌组织。已发现，EPB在鼻咽细胞和组织中普遍低表达，过表达EPB具有抑制鼻咽癌细胞侵袭迁移的功能；生物信息学及实验提示EPB可能表观遗传调控TGFBR1基因表达且RIP实验证实EPB可与EZH2结合，因此我们提出“lncRNA EPB41L4A-AS2通过招募EZH2下调TGFBR1表达抑制鼻咽癌侵袭转移”的科学假说。本研究拟通过过表达/沉默技术，体内外评估EPB在鼻咽癌细胞侵袭转移中的作用；以TGFBR1为线索，结合RIP、ChIP 等表观遗传学技术及拯救实验等方法结合临床验证，阐明EPB通过招募EZH2下调TGFBR1抑制鼻咽癌侵袭转移的分子机制。目前未见EPB抑制鼻咽癌侵袭转移报道，本研究可为鼻咽癌防治提供新靶标。

【目的】分析LncRNA EPB41L4A-AS2在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)组织中表达与临床预后的关系，探究其在鼻咽癌细胞中的生物学功能及其背后的分子作用机制.【方法】利用rt-PCR技术分析lncRNA EPB41L4A-AS2在鼻咽癌组织和细胞内的表达水平；利用CCK8，EDU，克隆平板形成试验分析处理过细胞的增殖活性，利用划痕和Transwell侵袭与迁移实验探究NPC细胞的侵袭与迁移能力。利用RNA-pull down，质谱实验，RIP实验分析lncRNA EPB41L4A-AS2可能锚定的蛋白，荧光素酶实验分析与miR-107的关系。利用构建的裸鼠腘窝转移模型体内动物水平分析lncRNA EPB41L4A-AS2对NPC细胞转移能力的作用.【结果】TGF-β因子能够在NPC细胞中利用经典的SMAD通路抑制lncRNA EPB41L4A-AS2的表达；lncRNA EPB41L4A-AS2好的预后密切相关，而与患者的性别，年龄，临床分期，肿瘤大小无关。单因素和多因素分析结果显示lncRNA EPB41L4A-AS2的表达是患者总生存和无进展生存期的独立预后因素。细胞功能学实验结果表明lncRNA EPB41L4A-AS2对细胞的增殖活性作用不明显，但是能够显著抑制NPC细胞的侵袭与转移能力。亚细胞定位实验结果提示lncRNA EPB41L4A-AS2在NPC细胞的胞质和细胞核内均有分布。在细胞核内，lncRNA EPB41L4A-AS2可绑定YBX1蛋白调控癌基因Snail的mRNA稳定性，进而逆转NPC的EMT进程，抑制NPC的侵袭与迁移作用。而在细胞质内，lncRNA EPB41L4A-AS2可作为miR-107的“分子海绵”，抑制miR-107的表达，促进LATS2发挥肿瘤转移抑制因子的作用。.【结论】lncRNA EPB41L4A-AS2是一个在NPC中低表达的lncRNA，其表达水平与临床特征和预后密切相关。在NPC细胞中，分别绑定YBX1调控Snail逆转EMT进程，“海绵吸附”miR-107激活LATS2作用，抑制NPC细胞的侵袭与转移作用。有望成为将来NPC治疗的新靶点。