镉诱导金属硫蛋白在华溪蟹组织细胞中的定位与原核表达

华溪蟹金属硫蛋白（MT）的原核表达以及在组织细胞中的定位尚未见报道。本课题组在6次获得国家自然科学基金资助，以及与本课题相关的前期工作取得标志性成果的基础上，首先采用基因重组技术，构建MT的高效表达载体，转入大肠杆菌生产重组MT；其次采用Real-Time PCR和荧光原位杂交技术，从分子水平定量检测镉诱导MT mRNA在主要组织器官的差异表达；最后以重组MT为抗原制备兔源的多克隆抗体，进行镉诱导MT不同组织器官的免疫组织化学及细胞化学研究，从蛋白水平探讨MT的组织分布和细胞定位。通过研究，为建立科学的重金属污染风险评价体系提供支撑，为水体环境和渔业环境监测及人工养殖水质管理提供参考，为MT的大规模生产和利用转MT基因藻类进行重金属污染治理提供可能，为深入探讨MT参与体内必需金属元素调节和非必需金属元素解毒机制提供依据，为弥补无脊椎动物，特别是甲壳动物MT研究的不足提供可能。

本项目的研究内容包括三部分：（1）华溪蟹MT重组蛋白的制备; （2）华溪蟹MT mRNA的差异表达;（3）华溪蟹MT的免疫组化研究。在项目实施中，严格按照资助计划书的研究内容执行，圆满并超额完成了预期研究目标，取得了标志性的研究成果。完成了河南华溪蟹金属硫蛋白（MT）的原核表达和重组蛋白的制备。河南华溪蟹MT在phoA中获得可溶表达，获得了高纯度MT重组蛋白。筛选得到抗河南华溪蟹MT单克隆抗体，该抗体亚型为IgG1，能特异性地识别重组6HIS-MT和SUMO-MT。采用荧光原位杂交及RT-PCR法检测了MT mRNA在鳃中的定位及诱导表达情况，观察了鳃组织细胞的形态学变化，测定了MT蛋白含量，证明了MT蛋白定位于鳃组织的上皮细胞，发现了MTmRNA和MT蛋白水平的变化趋于一致。获得了河南华溪蟹MT在PET-28a-SUMO中的高效表达产物，对MT的一级结构进行了部分改造，构建了两种突变体SUMO-MTt1（N2C）和SUMO-MTt2（S36C），诱导表达了SUMO-MTt1、SUMO-MTt2和SUMO-MT三种融合蛋白并分析了它们的抗重金属能力。.发表论文17篇，其中SCI核心期刊收录6篇；申请专利2项；培养博士1名、硕士8名，博士后2名；参加国内外学术会议13次，其中国际会议4次，大会报告6次，参加人有梯队教师5人、博士生4人、博士后3人。期间，项目负责人王兰教授作为山西大学首批生物学一级学科博士点优秀学科带头人，组织相关梯队力量获准了山西省普通高校特色重点学科建设项目“生物技术在提升山西特色生物资源效益中的应用”连续五年的资助，为学科建设主动服务地方转型跨越发展、为山西大学创办 “具有鲜明地方特色的高水平研究型大学”搭建了良好的平台。.课题负责人及团队成员先后赴美国交流学习。王兰教授于2011年8-11月，赴美国尼古拉斯州立大学生物系高访，期间为生物系全体师生做了专场学术报告，受到老师和学生的高度评价，扩大了学科团队在国际上的影响。魏克强副教授于2011年3-10月赴美国耶鲁大学免疫学研究所进行为期6个月的合作研究；马文丽副教授于2012年3月至2014年3月赴美国哈佛大学医学院进行为期三年的合作研究；李瑞金副教授于2011年10月至2012年4月赴美国加州大学河滨分校进行为期6个月的合作研究。引进山西省“百人计划”特聘教授2名。