Streptomyces microflavus neau3生物合成农用抗生素尼莫克丁（nemadectin）机理研究

课题组2005年发现了产杀虫抗生素尼莫克丁新菌株S. microflavus neau3，与美国氰胺公司工业化生产尼莫克丁菌株S. cyaneogriseus sp. noncyanogenus比较，它们不仅微生物种不同，而且代谢产物不同，新菌株除代谢尼莫克丁外，还生物合成2个新结构化合物。为揭示新菌株生物合成尼莫克丁的机理，构建菌株基因组文库，根据报道的氰胺公司产业化菌株生物合成尼莫克丁基因簇等设计引物，菌落PCR从文库中筛选阳性克隆，测序并组装，绘制新菌株生物合成尼莫克丁基因簇连锁图；利用已建立的遗传操作体系，通过体内基因敲除与回补、体外蛋白表达与酶促分析、产物分离与结构解析，明确基因簇中关键基因的功能，从源头上认识新菌株生物合成尼莫克丁的机制。这既可能发现新的尼莫克丁生物合成途径，也对提高新菌株产尼莫克丁单位产量、调控水平及构建产新活性化合物的基因工程菌有重要指导意义和实际应用价值。

以课题组发现、有产业化前景的产杀虫抗生素尼莫克丁及3个新化合物的S. microflavus neau3新微生物为研究对象，揭示S. microflavus neau生物合成尼莫克丁的机理，为构建高产、优良产尼莫克丁工程菌奠定基础。.克隆S. microflavus neau 3生物合成尼莫克丁基因簇。基因簇全长80,358bp。包含12个开放阅读框，分别为nemR, nemG, nemF, nemA1-1, nemA1-2, nemA2, nemC, nemD, nemE, nemA3, nemA4, orf1区域。通过体外表达及酶催化反应，和体内中断，重点研究明确了nemD基因的功能，nemD为S-腺苷酸-L-蛋氨酸依赖的甲基转移酶，催化尼莫克丁产生杂质5-甲氧基尼莫克丁。经体内中断nemD基因、多次筛选及发酵配方和培养条件的优惠，获得了不产杂质5-甲氧基尼莫克丁优良、高产基因工程菌，发酵单位产量达到4100mg/ml，比野生菌株的13mg/ml提高315倍。.进一步通过体内中断研究了C23位的酮基还原酶（C23-KR）的功能。为了使KR结构域失活，将 Nemadectin A1-2基因序列的KR序列中Tyr（TAC）突变成 Phe (TTC)。采用SOE法点突变获得KR点突变PCR产物，将酶切后的粘粒和突变PCR产物电击转化入E.coli/BW25113/pIJ790中，PCR targeting方法构建含突变KR的粘粒。然后将大肠杆菌ET12567/pUZ8002和Nemadectin产生菌接合转移，接着将获的的单交换菌株在没有Kana抗性的平板上长几轮，获得Kana敏感的菌株，然后再挑选菌株进行PCR验证，最终获得KR突变的菌株。经发酵、分离纯化及核磁、质谱、高分辨质谱、红外、紫外分析，鉴定出突变菌株的新化合物为C23-酮基尼莫克丁，新化合物C23-酮基尼莫克丁工程菌最高产菌株单位产量为3300g/ml。.完成了S. microflavus neau 3放线菌的全基因组测序。.研究明确了S. microflavus neau 3生物合成尼莫克丁机理，并构建了莫克丁高产、代谢杂质少的优良工程菌，以及构建减少半合成莫西克汀步骤、新化合物C23-酮基尼莫克丁工程菌。这些研究对加快我国拥有自主知识产权的产尼莫克丁新微生物产业化步伐具有非常重要价值。