农用抗生素尼莫克汀生物合成新调控子vWA作用的分子机制

Taking the whole genome sequenced Streptomyces cyaneogriseus ssp. noncyanogenus and its metabolite which acts as agricultural antiinsect antibiotic nemadectin as the object, this study acquired mutant pNMT16 by transposon mutagenesis approach in the preliminary work. The mutant performed lower yield of nemadectin significantly comparing to wild type, and the titer reached only 5.85% of WT. It was identified that Von Willebrand Factor A was interrupted by transposon insertion. vWA is widespread secretory protein in mammal, there is no report about vWA in actinomycetes so far, and the results showed that vWA has influence on synthetic process of nemadectin. We will employ gene knockout, overexpress and complementary to determine the gene function of vWA in nemadectin synthetic process, take the gel shift assay, transcription start site analysis and footprinting to identify downstream target gene and the specific binding gene sequence, moreover, research on the upstream regulatory genes and their interaction. This study explore the molecular mechanism of this gene during the biosynthesis and metabolic process, and provide important theoretical foundation and guidance for constructing fine nemadectin producing strains and increasing fermentation yield per unit.

本项目以完成全基因组测序的蓝灰链霉菌及其代谢产物农用杀虫抗生素尼莫克汀为研究对象，前期通过转座诱变筛选得到突变株pNMT16，在相同发酵条件下，突变株尼莫克汀产量显著下降，效价仅为野生型的5.85%，经鉴定pNMT16的Von Willebrand Factor A基因发生了转座插入。vWA是普遍存在于哺乳动物血浆中的分泌蛋白，目前在放线菌中没有报道，前期结果显示vWF对蓝灰链霉菌尼莫克汀的生物合成过程产生影响。拟采用基因敲除、过表达与回补，确定vWA基因在尼莫克汀合成过程中的功能；通过凝胶阻滞、转录起始位点分析及足迹实验，鉴定vWA基因作用的下游靶基因及其与靶基因启动子的具体结合序列；进一步研究vWA基因的上游调控基因及相互作用关系。本研究首次发掘该基因在尼莫克汀生物合成及代谢过程中的分子作用机制，为构建尼莫克汀优良菌株，提高尼莫克汀发酵单位产量提供重要的理论依据和指导。

本项目以完成全基因组测序的蓝灰链霉菌及其代谢产物农用杀虫抗生素尼莫克汀为研究对象，为了研究VwfA对尼莫克丁生物合成的作用，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对vwfA进行敲除。结果发现，敲除vwfA后，蓝灰链霉菌不再产生尼莫克丁，而基因回补后，恢复了尼莫克丁产生能力，表明VwfA是尼莫克丁生物合成所必需的。通过半定量RT-PCR分析表明VwfA正调控尼莫克丁生物合成基因簇的转录。根据共转录分析结果表明尼莫克丁生物合成基因簇至少含有两个大的转录单元nemA1-1/A1-2/A2和nemA4/A3/E/D。随后在体内通过gusA（编码β-glucuronidase，GUS）报告基因系统确定，VwfA直接调控nemA1-1/A1-2/A2，和nemA4/A3/E/D的转录，初步表明VwfA是尼莫克丁生物合成的途径特异性调控因子。利用纯化浓缩的蛋白VwfA进行体外electrophoresis mobility shift assays（EMSA）和DNase I footprinting实验来确定VwfA在靶基因启动子上精确的结合序列。结果表明：VwfA通过识别结合nemA1-1和nemA4启动子中一段18 bp高度保守的序列（5’-TGGGGTGKATAGGGGGTA-3’，K=T/G）来直接调控nemA1-1/A1-2/A2和nemA4/A3/E/D的转录。将这段保守序列随机突变后进行EMSA实验，结果发现VwfA不能结合突变后的启动子，表明这18 bp保守序列在VwfA结合靶基因nemA1-1/A1-2/A2和nemA4/A3/E/D的启动子过程中是必不可少的。利用这段高度保守的序列，通过RAST和MAST/MEME对蓝灰链霉菌进行全基因组扫描，寻找出50个VwfA其他潜在的靶基因。本研究首次发掘该基因在尼莫克汀生物合成及代谢过程中的分子作用机制，为构建尼莫克汀优良菌株，提高尼莫克汀发酵单位产量提供重要的理论依据和指导。