转录起始RNA对神经母细胞瘤中肝素酶表达的调控作用及其机制研究

Transcription initiation RNAs (tiRNA), a novel class of endogenous small non-coding RNA, can regulate gene transcription via modulating the density of CCCTC-binding factor (CTCF) at the loci downstream the transcription initiation site. Our preliminary data have revealed the high expression of heparanase (HPA) in neuroblastoma (NB) tissues, which was closely related with tumor progression. CTCF may inhibit the HPA expression of NB cells through inducing histone deacetylation, and tiRNA targeting the CTCF binding site can promote the cellular HPA promoter activities. Based on these findings, this project is proposed to observe the regulatory effects of CTCF on the promoter activities, histone deacetylation, and transcription of HPA in NB tissues and cell lines by reporter gene transfection, chromatin immunoprecipitation, and nuclear run-on assay. The interaction between tiRNA and CTCF and its influence on the CTCF binding to target loci of HPA will also be explored by RNA immunoprecipitation and chromatin immunoprecipitation. After stable transfection of tiRNA mimic and sponge vectors, the changes of HPA expression, proliferation, invasion and metastasis of NB cells will be further investigated. This study will define the roles and underlying mechanisms of tiRNA in regulating the HPA expression in NB, which will provide a novel strategy for NB therapy.

转录起始RNA（tiRNA）是一类新发现的内源性小非编码RNA，能影响CCCTC结合因子（CTCF）与转录起始位点下游非编码区的结合，调控基因转录。我们初步发现：神经母细胞瘤（NB）组织中肝素酶（HPA）高表达，与肿瘤恶性进展密切相关； CTCF可能通过组蛋白去乙酰化修饰抑制NB细胞HPA表达，而靶向CTCF结合位点的tiRNA能促进瘤细胞中HPA启动子活性。本课题拟通过报告基因转染、染色质免疫沉淀、核连缀转录等方法，观测CTCF对NB组织和细胞中HPA启动子活性、组蛋白去乙酰化及基因转录的调控作用；运用RNA免疫沉淀、染色质免疫沉淀法观测NB组织和细胞中tiRNA与CTCF的相互作用及其对CTCF结合至HPA靶位点的影响；建立tiRNA稳定过表达/拮抗体系，探讨其对HPA基因表达及NB增殖、侵袭转移的影响，旨在揭示tiRNA对NB中HPA表达的调控作用及其机制，为NB的治疗提供新途径。

神经母细胞瘤是婴儿及儿童期常见的颅外恶性肿瘤，起源于胚胎神经嵴，恶性度高、发展迅速，且易发生多部位转移。肿瘤增殖、侵袭转移相关基因肝素酶 (HPA) 在神经母细胞瘤组织中高表达，但其表达调控机制尚未完全阐明，靶向调控途径有待深入解析。本研究发现：转录因子CCCTC结合因子(CTCF) 在神经母细胞瘤组织和细胞中表达，与HPA表达水平负相关。荧光素酶-报告基因、染色质免疫沉淀、核连缀转录实验证实：CTCF能靶向结合至HPA启动子区域，导致组蛋白去乙酰化，抑制HPA基因的转录活性；神经母细胞瘤组织和细胞高表达靶向HPA转录起始位点下游CTCF调控位点的转录起始RNA (tiRNA)，与HPA表达水平正相关；RNA免疫沉淀、染色质免疫沉淀检测发现tiRNA能结合CTCF蛋白，阻遏CTCF蛋白作用于HPA启动子的调控位点，进而促进神经母细胞瘤细胞中HPA基因转录和表达水平。通过建立稳定过表达或拮抗tiRNA的神经母细胞瘤亚克隆细胞株，进一步发现tiRNA能通过靶向上调HPA基因表达，促进神经母细胞瘤细胞的体内外增殖、侵袭转移、血管生成活性，且在神经母细胞瘤恶性进展中发挥重要作用。因此，本项目率先在国内外揭示了tiRNA对神经母细胞瘤HPA表达的调控作用及机制，从新型内源性小非编码RNA角度，丰富了HPA基因表达的调控机理，为神经母细胞瘤的治疗提供了新途径和研究基础，具有广阔的应用前景和潜在的社会、经济效益。