TMEM16A Ca2+激活Cl-通道对高血压血管内皮氧化应激的作用及机理研究

Our previoes study has proved that TMEM16A was the candidate for calcium-activated chloride channel (CaCC) and played an important role in hypertension-induced cerebrovascular remodeling. However, the function of TMEM16A involved in oxidative stress in endothelial cells during hypertension is still elusive. Our pre-experiment showed that TMEM16A was abundant in human umbilical vein endothelial cells. AngiotensinⅡ (AngⅡ) potentiated the expression of TMEM16A, gp91phox and p22phox, the last two were the subunits of NADPH oxidase. Knockdowning of TMEM16A could ameliorate the upregulation of gp91phox and p22phox. It suggested that TMEM16A was involved in the process of oxidative stress in endothelium during hypertention. Based on the studies before, we intend to investigate the mechanism of TMEM16A regulates the oxidative stress in the endothelium of TMEM16A endothelial conditional null mice during hypertension and in primary cultured human umbilical vein endothelial cells. Our experimental techniques include patch clamp, molecular biological techniques and AngiotensinⅡ-induced hypertensive model. Our study will throw a new light on the mechanism of endothelium injuries during hypertension in terms of chloride channels, and provide a new way for developing new drugs of prevention and treatment of endothelium injuries during hypertension.

本课题组已证明，TMEM16A是Ca2+激活Cl-通道的分子基础并参与了高血压脑血管重构，然而TMEM16A在高血压血管内皮氧化应激损伤中的作用还不清楚。预实验显示，在内皮细胞中有内源性TMEM16A的表达，血管紧张素Ⅱ可引起内皮细胞TMEM16A以及NADPH亚基gp91phox和p22phox表达升高，当干扰TMEM16A表达后，gp91phox和p22phox的表达恢复正常，提示TMEM16A参与了高血压血管内皮细胞的氧化应激过程。因此，本课题拟在本组研究工作基础上，结合膜片钳记录Cl-电流、分子生物学技术以及AngiotensinⅡ诱导高血压动物模型，探讨TMEM16A对血管内皮细胞氧化应激的作用及机制，并检测TMEM16A内皮条件性敲除对高血压血管内皮氧化应激的影响，从Cl-通道这一新的角度阐明高血压血管内皮氧化应激的发病机制，并为寻找防治高血压血管内皮损伤的新药提供新的线索。

本课题组已证明，有两种Cl-通道参与了高血压脑血管重构过程，包括TMEM16A及ClC-3。在血管平滑肌中，TMEM16A是Ca2+激活Cl-通道（CaCC）的分子基础，而ClC-3是容积调节性Cl-通道（VRCC）的分子基础。然而，TMEM16A在高血压血管内皮中的表达及作用，以及ClC-3在高血压血管平滑肌中的激活机制还不清楚。本研究采用膜片钳、分子生物学、激光共聚焦等实验手段；动物方面，我们构建了TMEM16A血管内皮特异性过表达及敲除小鼠和ClC-3全基因敲除小鼠，并埋植血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）渗透压泵建立高血压模型；细胞方面，我们使用了原代培养的小鼠血管内皮及平滑肌细胞、人脐静脉内皮细胞、平滑肌A10细胞系，并给予AngⅡ进行刺激。研究结果显示：（1）在血管内皮中，TMEM16A表达丰富，并同样是CaCC的分子基础；（2）在AngⅡ诱导的高血压过程中，血管内皮TMEM16A表达及活性升高；（3）内皮特异性敲除TMEM16A可降低AngⅡ引起的高血压并保护血管内皮功能，而内皮特异性过表达TMEM16A可进一步恶化AngⅡ引起的高血压并损伤血管内皮功能；（4）TMEM16A对血压及血管内皮功能的影响，与其促进Nox2亚型NADPH氧化酶的活性并促进活性氧（ROS）的产生有关；（5）Nox2亚型NADPH含有5个亚基，包括位于胞膜的Nox2、p22phox以及位于胞浆的p47phox、p67phox、Rac1，TMEM16A与p22phox竞争性与Nox2结合，从而降低Nox2的泛素化降解，也就是稳定了Nox2的表达，因此增加了Nox2亚型NADPH氧化酶的活性；（6）TMEM16A还可促进p47phox及p67phox从胞浆向胞膜转位，并增加这两者与Nox2的相互结合，从而增加了Nox2亚型NADPH氧化酶的活性；（7）在血管平滑肌中，AngⅡ可激活ClC-3依赖的Cl-通道；（8）AngⅡ促进ClC-3与ROCK2相互结合，进而磷酸化ClC-3的T532位点，从而促进血管平滑肌细胞的迁移；（9）ROCK2抑制剂Y27632可抑制AngⅡ引起的血管平滑肌细胞迁移及脑血管重构。该项目从血管内皮及平滑肌的角度，探讨了TMEM16A及ClC-3这两种Cl-通道在高血压中的作用，为评估这两种Cl-通道是否可作为防治高血压内皮功能不全及脑血管重构的新靶点提供实验室依据。