TMEM16A Ca2+激活Cl-通道对高血压内皮祖细胞内皮修复的作用及机制研究

Endothelial progenitor cells (EPC) play a significant role in re-endothelialization of injured blood vessels. Our previous study has demonstrated that TMEM16A is the molecular candidate for calcium-activated chloride channel (CaCC) and plays an important role in hypertension-induced cerebrovascular remodeling. However, whether TMEM16A is involved in the regulation of EPC function is still unclear. In our pilot study, we found that TMEM16A is expressed in both mature endothelial cells （EC）and EPC, and its expression was significantly increased by Ang II. TMEM16A knockdown inhibited AngII induced O2- production in EC, and increased the endothelial dependent vascular relaxation in aorta of Ang II infused hypertensive mice, implying a functional role of TMEM16A in endothelial function. Therefore, the objective of this project is to determine how TMEM16A would influence the EPC number and function as well as its reendothelialization capacity in both AngII-induced hypertensive mice and hypertensive patients. Our proposed research may provide new insights regarding the effects of TMEM16A in cardiovascular diseases featuring EPC dysfunction and also provide a mechanistic basis for developing new target for drug production to combat EPC damage and endothelial dysfunction in hypertension.

内皮祖细胞 (EPC) 在维持血管内皮完整性中发挥了重要作用。我们预实验结果证实TMEM16A是钙激活氯通道的分子基础，在成熟内皮细胞及EPC中均表达内源性TMEM16A，血管紧张素II可引起TMEM16A表达增加，干扰TMEM16A可抑制AngII 诱导的内皮细胞O2-生成，并改善AngII 诱导的高血压小鼠内皮依赖性血管舒张，提示TMEM16A参与了高血压内皮功能维护，然而该作用是否与TMEM16A调节EPC功能有关尚不清楚。在此基础上，本项目拟在TMEM16A内皮条件性敲除及高表达小鼠上建立AngII诱导的高血压模型，并提取高血压病人的外周血EPC，探讨TMEM16A对高血压EPC功能的调节作用，并通过建立颈动脉内皮损伤模型，探讨TMEM16A对EPC介导的内皮修复的作用，从氯通道这一新的角度阐明心血管疾病EPC 功能受损的机制，并为寻找防治EPC 及内皮损伤的药物新靶点提供线索。

TMEM16A为Ca2+激活Cl-通道的分子基础，我们以往研究发现其参与了高血压诱导的内皮功能不全，提示TMEM16A在高血压的发生发展中起了重要的作用。内皮祖细胞（EPC）在维持血管内皮完整性中发挥了重要作用，然而TMEM16A是否参与了EPC的功能调控及其介导的内皮损伤的修复仍不清楚。在本项目中，我们采用TMEM16A内皮特异性基因敲除及过表达小鼠以及腺病毒转染TMEM16A siRNA和cDNA等技术，探讨该通道蛋白对EPC数目和功能的影响及其机制。结果发现，无论在高血压的病人还是高血压的小鼠EPC中TMEM16A的表达均明显升高，且与血压值成正相关。与正常血压相比，高血压EPC的功能和损伤内皮的修复能力均受到抑制，与高血压诱导的结果相一致的是，TMEM16A过表达同样能够抑制EPC的迁移，粘附和体外血管形成能力，在内皮特异性TMEM16A过表达的小鼠建立颈动脉拉脱模型，其损伤内皮的修复能力与对照组相比显著下降，外周血EPC动员能力也显著降低, 这些结果提示高血压可能通过增加TMEM16A的表达而抑制EPC功能和内皮稳态的维持。进一步通过利用内皮特异性敲除TMEM16A的小鼠和siRNA技术，发现降低TMEM16A的表达能够促进EPC的功能，并显著逆转高血压诱导的EPC功能降低，改善高血压状态下受损的内皮修复能力。进一步研究发现，TMEM16A过表达不影响EPC中SDF-1/CXCR4的表达水平，但EPC的分化能力降低，细胞中VEGFR2和CD31的表达明显下降，该作用与TMEM16A抑制LRP-6和GSK-3β的磷酸化，降低GSK-3β的降解，并由此促进β-catenin的降解，使β-catenin的水平下降，从而抑制Wnt通路，降低EPC功能蛋白VEGFR2和CD31的表达有关。TMEM16A siRNA敲低或内皮特异性敲除则可促进上述Wnt通路的激活，并逆转高血压引起的Wnt通路抑制。该研究从分子水平、细胞水平、整体水平、及临床角度， 探讨了TMEM16A 氯通道表达变化对高血压发生发展过程中EPC数目及功能的影响及机制，并通过小鼠颈动脉内皮损伤模型揭示了TMEM16A与EPC介导的受损血管内皮修复之间的关系，为评估TMEM16A是否可作为防治心血管疾病EPC受损的新措施及内皮损伤的药物作用新靶点提供实验室依据。