预处理生物质木质素对纤维素酶的吸附抑制机制及酶修饰机理研究

A great hindrance in commercial production of cellulosic ethanol is the unproductive adsorption of lignin. It can be effectively improved by the combination of pretreatment and cellulase modification. However the inhibition mechanism of cellulase adsorption by lignin and the internal relation between cellulase modification and its hydrolysis properties are not unclear. In this project, the residual lignins are separated from pretreated forestry and agricultural residues and their characters such as molecular weight, functional group, wettability, charge density and so on are detected. And then the relationships between the characters of residual lignins and cellulase adsorption ability, constituents of cellulase, conformation change of protein and enzyme activity are deep studied to reveal the inhibition mechanism of lignin and make clear the effect of lignin adsorption on the composition of cellulase. In addition, the hydrophilic and electronegative polymer of HO-PEG (polyethylene glycol)-COOH is chosen to modify the enzymes which can be easy adsorbed by residual lignin. Based on the inner connection between characters of modified cellulase and unproductive adsorption of residual lignin, enzymatic hydrolysis and phase separation characterization, the best modified cellulase is screened out, which can effectively decrease the unproductive adsorption of residual lignin, efficiently hydrolyze the cellulose of biomass and be recycled by attemperation. This study provides a practical significance for reducing the cost of cellulosic ethanol production.

木质素对纤维素酶的无效吸附是纤维乙醇工业化生产的重要阻碍，从生物质原料预处理和酶修饰两方面同时入手是有效改善手段。然而，木质素对纤维素酶系组分的吸附抑制机制以及修饰酶结构特点与其水解特性之间的内在联系尚不明确。本项目通过系统研究预处理残留木质素分子量、结构基团、亲水/疏水性、表面负电性等物理化学特性与纤维素酶吸附能力、组成成分、构象变化、水解活力等特性之间的关系，阐明木质素对纤维素酶的吸附抑制机制，明确无效吸附对纤维素酶系组分的影响；采用亲水、负电以及温敏特性的羟基-聚乙二醇-羧基聚合物着重对易与木质素结合的纤维素酶组分进行修饰，基于修饰酶结构特征与无效吸附、水解转化、相分离特性之间的内在联系，制备出稳定、高效、可温控自分离的新型修饰纤维素酶。研究成果将有效降低木质素对纤维素酶的无效吸附，高效转化木质纤维原料中的纤维素，实现酶的回收利用，对降低纤维乙醇工业化生产成本有重要的现实意义。

农林生物质资源经糖平台转化可生产各种燃料和化学品，是我国能源发展战略的重要内容。然而，木质素对纤维素酶的吸附抑制阻碍了其大规模工业化生产。预处理和酶修饰相结合的方式可显著改善底物的水解糖化效率，降低生产成本，加速工业化进程。. 以我国丰富的玉米秸秆为原料，采用两种典型预处理方法进行预处理。通过底物结构特性的解析和酶水解糖化效率的对比研究，揭示了底物特性与纤维素酶水解之间的关联机制。预处理破坏了顽固的细胞壁结构、降低了木质素含量（特别是表面木质素含量）、提高了底物亲水性、改善了底物的可接触性，从而显著提高了纤维素酶的水解糖化效率。同时，开发出了最佳的对甲苯磺酸预处理工艺，葡萄糖得率达95%以上，溶剂多次回收利用后仍有良好效果。. 以四中预处理残留木质素为研究对象，通过木质素物理化学特性与纤维素酶吸附行为之间关联机制的研究，阐明了木质素的吸附抑制机制。预处理降低了木质素的疏水性和表面负电荷密度，从而减弱了其对纤维素酶的吸附能力。木质素主要吸附纤维素酶系中的CBHII组分，破坏了各组分间的协同作用。木质素的吸附作用还破坏了残余纤维素酶的空间结构，改变了芳香族的氨基酸残基空间分布和二级结构的相对含量（特别是降低了α-螺旋结构的相对含量），使紧密的蛋白质空间结构变得松散，从而影响了纤维素酶的水解能力。. 基于木质素吸附抑制机理的探究，采用亲水、负电的羟基-聚乙二醇-羧基（HO-PEG-COOH）和羧基-聚乙二醇-羧基（HOOC-PEG-COOH）对纤维素酶表面氨基进行化学修饰，成功制备出了水解活性高、稳定性强、木质素吸附能力低的新型修饰纤维素酶。化学修饰改变了纤维素酶的空间结构，使具有稳定作用的α-螺旋结构含量显著增加，改善了酶的稳定性（尤其是酶的热稳定性显著提高）和水解活性。修饰剂的引入提高了纤维素酶的亲水性和表面负电荷密度，改善了其抵抗木质素吸附的能力。木质素吸附后，残余修饰纤维素酶的空间结构破坏程度较小，尤其是α-螺旋结构含量的降低程度明显改善。