阻断connexin43依赖性细胞非并列连接对脑缺血损伤的保护及机制研究

Ischemic stroke, one of the diseases with high incidence, high disability, high mortality. So far, there is no effective treatment. Neurovascular unit (NVU) was proposed a new concept of neuroprotective targets expanded from neurons to the full protection on the neurovascular unit, including neurons, glial cells, and endothelial cells.Connexin 43 dependent cell junction conjugate unparallel channel (CX43Hc) exists extensively in NVU, which mostly express in AST. Various cytokines release through this channel,produce physiological and pathological effects after injury stimulation. Our previous results indicated that connexin 43 mimetic peptide Gap26 could significantly reduce the cerebral infarction area in cerebral ischemia/reperfusion(I/R) mice model. However, this protective mechanism is still unclear. Based on the previous research, we will further investigate protective effects of Gap26, and clarify the underlying relationship between mechanism of NVU and it’s functional change through selectively block CX43Hc. Our project will provide a new target for the treatment of ischemic stroke and drug development.

缺血性脑卒中具有高发病率、高致死率及高致残率的特点，目前临床尚无有效的神经保护治疗方案。近年来随着神经血管单元这一新概念的提出，神经保护的目标从单一的神经元扩展为对包括神经细胞、胶质细胞和血管内皮细胞在内的神经血管单元（NVU）的全面保护。连接蛋白43依赖型细胞连接非并列通道（CX43Hc）广泛存在于NVU各组分间，尤其在星形胶质细胞（AST）中存在最多，损伤性刺激下，各类细胞因子通过该通道传播并产生各种病理生理效应。我们前期的研究表明CX43Hc选择性阻断肽Gap26能在脑缺血动物模型中显著减小脑梗死体积。但这一保护作用的机制尚不清楚。在前期研究的基础上，本课题将在进一步证实Gap26神经保护作用的同时，从细胞水平和整体水平研究选择性阻断CX43Hc对缺血性脑损伤的保护机制及与NVU结构功能变化的关系。本研究将为缺血性脑卒中防治提供新的思路及理论依据。

研究的背景和目的：CX43依赖性细胞非并列连接（CX43Hc）作为神经血管单元各组分间的桥梁，在缺血性脑损伤的病理生理过程中起到重要的作用，本研究的目的是探索特异性阻断CX43Hc在缺血缺氧性脑病中的作用及相关机制，特别关注对神经血管单元的整体保护作用，为缺血缺氧性脑病的神经保护提供新的理论依据及治疗靶点。.重要实验方法及结果：CX43Hc特异性阻滞剂主要包括CX43小分子模拟肽：gap19、gap26；使用的细胞模型包括：原代神经血管单元各组分细胞的缺氧糖剥夺模型(OGD)，二氯化钴诱导的星形胶质细胞的化学性缺血模型；使用的动物模型包括：小鼠大脑中动脉缺血再灌注模型（MCAO）和新生大鼠缺血缺氧模型（HI）。分别使用TTC染色、尼氏染色和LFB染色观察脑组织的损伤情况，使用动物行为学测定神经功能的改善。使用Western blot测定：CX43、GFAP、cleaved-caspase3 、IRAK1、NF-κB p-p65、TNF-α、IL-1β、p-jak2、p-stat3、Akt、P-Akt、TLR4、MyD88等蛋白的表达及活化情况，使用免疫组化及免疫荧光定位CX43与上述凋亡及炎症关键因子及相关分子通路关键蛋白之间的内在联系，使用RNA小干扰、通道抑制剂及通道激动剂对相关分子通路进行干预，进一步明确特异性阻断CX43依赖性细胞非并列连接后神经保护作用的相关机制。结果显示特异性抑制CX43可以通过PI3K/Akt信号通路、TLR4信号通路及jak2/stat3信号通路的变化影响脑缺血缺氧后神经组织的凋亡和炎症的发生，抑制了星形胶质细胞的活化，对神经血管单元各组分有保护作用，对神经功能的缺损有明显的改善作用。.结论：CX43Hc的大量开放是导致缺血缺氧性脑损伤加重的重要原因，其机制与缺血缺氧损伤后神经血管单元各组成单位的炎症及凋亡及随后的大量坏死有关，特异性阻断该细胞通路，可以有效减少脑组织损伤，改善神经功能缺损，抑制脑缺血后星形胶质细胞过度活化所导致的神经损害，该作用主要与激活PI3K/Akt信号通路、jak2/stat3信号通路和抑制TLR4信号通路密切相关，上述保护作用不单一的作用于脑白质或脑灰质，而是通过保护整体神经血管单元各组份完成。本研究的完成为急性缺血缺氧性脑病提供了新的作用靶点及理论依据。