真菌纤维素酶与木质素非产出性吸附的分子机理研究及纤维素酶的改造

The development of lignocellulosic ethanol industry in China has a strategic importance for better energy security, lower air pollution, and a sustainable model for economic development. During the saccharification process of lignocelluloses, lignin present in the biomass results in a hampered enzymatic hydrolysis owe to the cellulase-lignin non-productive binding. The engineering of cellulases by reducing the non-productive binding to lignin is a potential method for increasing the conversion efficiency of cellulose in the biomass. In this project, the fusion protein of CBM (carbohydrate-binding module) and GFP will be constructed, the system for measuring the change of cellulase/lignin adsorption will be established and correlations between properties of amino acid residue at different sites in enzyme and lignin will be investigated. Furthermore, a new hypothesis will be studied that surface charges on CBM of cellulase have a significant effect on the cellulase-lignin non-productive binding. Based on the mechanisms of adsorption/desorption of cellulolytic enzyme onto/from lignin, technology of cellulase engineering will be developed and a new generation cellulase that increases the activity and reduces the cellulase-lignin non-productive binding will be prepared for improving the hydrolysis efficiency of lignocellulosic biomass.

在木质纤维素生物降解过程中，当木质素存在的情况下，木质素与纤维素酶会发生非产出性吸附，从而显著降低纤维素酶的水解效率。通过蛋白质工程等技术改造纤维素酶蛋白质结构，以减少木质素的抑制作用提高纤维素转化率，是当今国际上研究的热点。研究证明，纤维素酶结合结构域（CBM）和木质素发生吸附是造成纤维素酶失活的主要原因。本项目拟构建“荧光蛋白-纤维素酶CBM”融合蛋白突变体库，同时建立吸附度变化快速测量体系，从而筛选出和木质素吸附的纤维素酶关键氨基酸残基，从蛋白结构基础在分子水平揭示纤维素酶与木质素吸附-解吸附动态过程中的科学规律，并验证我们的新假说“纤维素酶CBM表面电荷与木质素非产出性吸附直接相关”，为理性设计纤维素酶提供坚实的基础理论平台。基于该理论，蛋白质工程精细改造纤维素酶CBM，研制木质素低吸附且高效降解秸秆的新型纤维素酶，并在预处理后的秸秆原料中验证，推动木质纤维素生物炼制产业的发展。

木质纤维素在酶解的过程中，木质素和纤维素酶之间会发生非产出性吸附，导致部分纤维素酶的失活，严重降低了木质纤维素的水解效率。纤维素酶的碳水化合物结合结构域（Carbohydrate binding module，CBM）被证明在纤维素酶与木质素之间非产出性吸附中起了重要的作用。.本研究构建了快速荧光检测（RFD）系统，利用该系统，与吐温或PEG相比，阳离子添加剂DTAB或polyDADMAC的添加大大提高了纤维素/木质素的分配系数，减少了木质素和纤维素酶之间的非产出性吸附，提高了木质纤维素的水解效率。polyDADMAC和DTAB的加入提高了Avicel和木质素混合物释放的葡萄糖产量，降低了木质素的抑制率。我们证实，木质素疏水性的降低和zeta电位的增加共同有助于抑制木质素的非产出性吸附，特别是，结果证明添加添加剂后木质素的zeta电位值与Avicel/木质素的分配系数具有良好的相关性，表明静电作用在纤维素酶对木质素的吸附中起着至关重要的作用。此外，我们对里氏木霉Cel7A进行了蛋白质工程改造。通过增加CBM表面的负电荷密度，促使Cel7A和木质素之间发生排斥，提高了CBM在纤维素吸附速率/木质素吸附速率的分配系数，降低了CBM与木质素之间的非产出性吸附。结果表明，当底物中存在木质素时，S14D/S21D/T24D变体的糖化效率提高。.本项目中，我们用坚实的数据证明我们提出新的假说，即纤维素酶CBM上的表面电荷对纤维素酶-木质素非产出性吸附有显着影响。并且基于这个纤维素酶对木质素的吸附/解吸机理，开发了新型纤维素酶。这个机理和技术，为制备新一代纤维素酶，提高纤维素酶-木质素非生产性结合的活性，减少纤维素酶-木质素非生产性结合，提高木质纤维素生物质的转化，提供了坚实的理论基础。