HIF-2A在骨关节退行性病变中的调控作用机制及其应用基础研究

Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease characterized by destruction of articular cartilage. However, no effective medical therapy to prevent OA cartilage destruction is currently available, owing to the limited understanding of the underlying molecular pathogenic mechanisms. The chondrocyte is a unique cell type in articular cartilage that is responsible for cartilage homeostasis and OA pathogenesis. Recently, It has been demonstrated that the transcription factor hypoxia-inducible factor (HIF)-2α, encoded by Epas1, is a catabolic regulator of cartilage destruction that acts by regulating the expression of various catabolic factors, including matrix-degrading enzymes and inflammation mediators. The regulation of HIF-2A gene and protein level in articular cartilage remains unknown. In this study, we attempted to explore the mechanisms in regulating the transcription and posttranscription of HIF-2A by using animal model of osteoarthritis and human chondrocytes, and confirm the roles of HIF-2A in lumbar disc or joint degenerative disease.

随着生活、工作方式的改变及社会人口的老龄化，骨关节退行性病变已成为高发疾病。骨关节退行性病变的发生与关节软骨损伤的病理密切相关。如何高效率地调控与恢复软骨基质蛋白代谢成为预防及治疗骨关节退行性病变的研究焦点。最新研究表明：HIF-2A诱导MMPs和Agrrecanases分泌，进一步促进胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的分解。由此，我们提出新的假说：在骨关节退行性病变中，调控HIF-2A基因表达及蛋白水平是靶向调节软骨细胞外基质代谢的一种有效途径，通过调节HIF-2A基因表达，抑制HIF-2A的蛋白水平和活性，即可达到抑制软骨退变的目的。本项目使用临床组织标本、细胞及动物模型，以分子生物学手法探讨HIF-2A在骨关节退行性病变中的分子调控机理，明确其在发病、发展中的作用，为骨关节退行性病变的生物学治疗提供新的途径及理论实验依据。

随着生活、工作方式的改变及社会人口的老龄化，骨关节退行性病变已成为高发疾病。如何高效率地调控与恢复软骨基质蛋白代谢成为预防及治疗骨关节退行性病变的研究焦点。本项目使用临床组织标本、原代椎间盘细胞和骨关节退行性病变动物模型，探讨HIF-2a在骨关节退行性病变中的调控机理，明确其在骨关节退行性病变中的作用。方法：1) 在X线透视定位下，经皮穿刺向椎间盘内注射Fibronectin片段的办法建立椎间盘退变模型。在注射后不同时间点取出间盘，进行组织化学染色，以及提取总RNA进行real time RT-PCR分析。2）利用健康16周龄雄性日本大耳白兔24只，清洁级，封闭群，体质量1.8～2㎏，按照随机、对照、均衡原则分为PBS对照组和CIOA实验组，每组12只。于造模后24周切取膝关节胫骨平台和股骨髁的新鲜软骨，一部分用于提取关节软骨总蛋白，另一部分用于总RNA提取。3)选取健康1月龄SPF级Hartley豚鼠132只，随机分为11组，每组12只，雌雄各半，间隔1个月处死并对膝关节取材，处死前纪录体重。随月龄增加，观察关节软骨退变情况、采用Micro-CT观察胫骨软骨下骨显微结构的改变情况、比较3月龄和1月龄豚鼠软骨及软骨下骨的蛋白表达差异。4）利用人椎间盘组织原代细胞进行HIF-2a信号通路实验。结果：经皮穿刺向椎间盘内注射Fibronectin 片段后，在椎间盘退变动物模型中HIF-2a明显的增加，而胶原和蛋白聚糖的基因水平明显的降低；CIOA组关节软骨表面粗糙，色泽晦暗，表面有糜烂及溃疡形成，负重区形成缺损，软骨下骨质暴露。CIOA组注射药物侧膝关节软骨组织中HIF-2a蛋白增加；在豚鼠实验中，1-2月龄的雌雄性豚鼠膝关节X线相比，3月龄开始雌雄性豚鼠膝关节间隙变窄。5月龄后，与雌性豚鼠相比雄性豚鼠关节软骨退行性改变更加严重。与1月龄相比，5月龄豚鼠膝关节软骨组织中HIF-2a蛋白表达显著增加。在细胞实验中，通过抑制NF-B活性或沉默HIF-2a，HIF-2a、MMP-13和ADAMTS-4的表达减少，而过表达HIF-2a使MMP-13和ADAMTS-4的表达量都有不同程度的增加。结论：HIF-2a通过NF-B参与骨关节退变过程，通过抑制HIF-2a表达可以减缓细胞外基质的降解。