asporin在椎间盘退变中的作用及机理的研究

腰椎间盘退变（LDD）是绝大多数脊椎退行性病变的发病基础。椎间盘退变的主要病理生理改变为椎间盘软骨细胞和细胞外基质成分的变化。因此如何高效率地调控椎间盘软骨细胞的基质合成已成为预防与治疗椎间盘退变的研究焦点。最新研究表明：存在于软骨细胞外基质中的蛋白asporin能够通过TGF-beta/Smad途径抑制软骨细胞基质的合成及分泌，与椎间盘退变等退行性疾病的发病呈正相关。由此，我们提出新的假说：调控asporin基因表达及蛋白水平可能是靶向调节椎间盘软骨细胞基质合成、达到修复及再生退变椎间盘的有效途径。本课题使用临床组织标本中提取的原代软骨细胞、人软骨细胞株-NHAC及椎间盘退行性病变动物模型，以分子生物学手法探讨asporin在椎间盘基质合成和分泌中的分子调控机理，明确其在椎间盘退行性病变中的作用，有望为脊柱退行性病变的生物治疗寻找新的途径，提供理论及实验依据。

腰椎间盘退变（IDD）是绝大多数脊椎退行性病变的发病基础。椎间盘退变的主要病理生理改变为椎间盘软骨细胞和细胞外基质成分的变化。本项目使用临床组织标本中提取的原代椎间盘细胞、人软骨细胞株-NHAC及椎间盘退行性病变动物模型，探讨asporin在椎间盘基质合成和分泌中的分子调控机理，明确其在椎间盘退行性病变中的作用。.利用原代椎间盘细胞试验中发现，在TGF-β1诱导下asporin转录水平显著提高，与TGF-β1呈现剂量与时间依赖关系。经敲除内源性asporin表达后，TGF-β1诱导合成细胞外基质（II型胶原蛋白和蛋白聚糖）显著上调。.在TGFβ诱导-Asporin合成的信号通路研究中，对原代人椎间盘纤维环细胞分别施以不同特异性激酶抑制剂SB203580、SP600125及U0126（分别抑制p38、JNK和ERK）进行处理，随后检测在此情况下TGFβ对asporin诱导能力的变化。结果显示阻断p38后，TGFβ对asporin的诱导作用消失，证实了p38即为TGFβ至asporin的中间环节。结果还显示在培养纤维环细胞中无明显JNK、SMAD3/4及GADD45β均无明显表达。.为了进一步验证人椎间盘细胞信号传导不同于软骨细胞，使用蛋白合成抑制剂CHX对细胞进行预处理后进行TGFβ刺激。结果显示CHX处理后asporin mRNA表达消失，p-p38的蛋白水平无明显变化，此结果说明在TGFβ诱导人纤维环细胞asporin表达的过程中需要新合成蛋白质的参与，但是因新合成蛋白质并不影响p-p38的水平，所以该蛋白在信号通路上应处于p-p38的下游。.随后还进行了TGFβ诱导p38激活和asporin表达的时相分析，结果显示TGFβ刺激15分钟后p-p38水平即显著增高，而asporin的表达增加出现在处理后2小时左右。.使用TAK1 siRNA和ca-TAK1质粒对TAK1在该信号通路中的上下游关系进行了验证，结果支持TGFβ-TAK1-p38α-？-asporin通路。.在椎间盘退变动物模型试验中，asporin主要表达于椎间盘纤维环中，其表达量随椎间盘退变程度的提高而增加。.asporin与椎间盘退变的发生具有一定的相关性；原代人椎间盘细胞与软骨细胞不同，TGFβ诱导-asporin的信号途径通过TAK1-p38α。