PEA3通过上调BMP-7阻断肾小管上皮-间充质转分化

肾小管上皮－间充质转分化（EMT）是导致肾小管损伤和间质纤维化的中心环节之一。课题组前期研究发现PEA3在胚胎肾发育中高表达，促进间充质细胞向正常肾组织结构转化，这与骨形态发生蛋白-7（BMP-7）在胚胎肾发育中的作用非常相似。由于BMP-7可通过阻断EMT而发挥独特的抗肾小管间质纤维化作用，我们预实验研究发现，PEA3可促进BMP-7表达并抑制EMT。由此我们推测：PEA3可通过诱导BMP-7表达而阻断EMT，发挥延缓甚至逆转肾小管间质纤维化的作用。本课题将通过过表达和表达沉默等技术，观察PEA3对肾小管上皮细胞EMT的影响及其作用的分子机制；在此基础上通过染色质免疫共沉淀、凝胶电泳迁移率实验以及虫荧光素酶报告基因系统等检测PEA3与BMP-7启动子的相互作用，并通过RNAi技术特异性抑制BMP-7/Smad信号通路，观察其对PEA3阻断EMT的影响，为EMT发生机制的研究提供新的视点。

肾小管间质纤维化是各种原因引起的CKD发展到终末期肾衰竭的共同归路。肾小管上皮细胞转分化(EMT)是导致肾小管间质纤维化的中心环节之一。课题组前期应用抑制性差减杂交技术构建新生大鼠和生后21天大鼠肾脏发育差减文库，发现多个拷贝的PEA3基因。PEA3在肾脏纤维化中的作用尚未见研究报道。本课题首先观察了PEA3在实验性肾脏病动物模型肾组织中的表达。结果发现UUO模型、庆大霉素肾损伤模型、阿霉素肾病模型、醛固酮灌注模型以及顺铂急性肾损伤模型肾组织中PEA3表达明显增加，主要表达于损伤的肾小管。随后，我们通过体外肾小管上皮细胞培养，探讨PEA3在EMT中的作用。研究发现PEA3过表达显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA、CTGF和ColI表达及smad2/3磷酸化，并上调E-cadherin和ZO-1表达，而抑制内源性PEA3表达可加重TGF-β1诱导的EMT；PEA3过表达可上调BMP-7 mRNA和蛋白表达及smad1/5/8磷酸化；敲低BMP-7著降低了PEA3对TGF-β1的保护作用；TGF-β1可诱导HK-2细胞发生线粒体功能障碍，主要表现为线粒体ROS产生增加、线粒体膜电位下降、线粒体DNA (mtDNA)拷贝数下降以及ATP生成减少；PEA3过表达可上调PGC-1α和TFAM表达，并阻断TGF-β1诱导的线粒体功能障碍；转染PGC1-α siRNA后减弱了PEA3对TGF-β1诱导的EMT和线粒体功能障碍的保护作用。在阐明PEA3在EMT中的作用后，我们有进一步探讨PEA3在全反式维甲酸(ATRA)阻断肾小管上皮细胞转分化中的作用。ATRA明显抑制TGF-β1诱导的体外培养的肾小管上皮细胞EMT以及UUO小鼠肾脏纤维化，降低TGF-β、α-SMA、ColI和CTGF表达。ATRA呈剂量依赖性上调BMP-7启动子活性，促进BMP-7 mRNA和蛋白表达及Smad1/5/8磷酸化，而BMP-7 siRNA阻断ATRA对EMT的抑制作用。ATRA促进肾小管上皮细胞中PEA3表达，敲低PEA3阻断了ATRA对EMT的抑制作用，并下调了BMP-7表达及Smad1/5/8磷酸化，表明ATRA通过诱导PEA3促进BMP-7表达及阻断EMT。ATRA受体RARα可与PEA3直接结合，且RARα、RXRα与PEA3可共同作用于ATRA诱导BMP-7表达的过程。