刺参腐皮综合症发生相关microRNAs的发掘和表达研究

MicroRNA（miRNA）是一类21～25个核苷酸的小分子非编码调控RNA，在病原和宿主相互作用的过程中发挥着重要作用。本项目立足于我国重要经济水产动物刺参（Stichopus japonicus Selenka），针对其主要疾病腐皮综合症的发生机制这一关键科学问题开展基础研究工作。采用实验室建立的小分子RNA克隆策略构建刺参疾病发生前后miRNA克隆文库，筛选和鉴定与病原侵染和疾病发生相关的miRNAs。在此基础上，结合LAN反义寡核苷酸探针的高灵敏性和特异性的优势，定性这些miRNA在疾病发生过程中的时空表达规律．最后，利用定量PCR技术研究刺参体腔细胞免疫相关基因在疾病发生过程中的表达变化，发掘和筛选与特定miRNA表达密切相关的功能基因，初步认识和掌握miRNA在调控刺参腐皮综合症发生中的内在作用机制，为开发针对性的该疾病免疫防治制剂提供基础资料。

项目组构建了刺参腐皮综合症发生前后刺参体腔细胞miRNA克隆文库文库，基于Illumina/Solexa测序基础上获得了潜在miRNA序列9,579,038条（对照组）和7,742,558条（疾病组），最终识别了40个保守的miRNA和86个新颖的miRNA；利用FPFKM算法表征了包括miR-31,miR-2008,miR-137,miR-133,miR-9,miR-200,miR-210,miR-124在内的8个差异表达miRNA，其中miR-2008和miR-31与刺参腐皮综合症发生密切相关；采用定量PCR技术系统阐明了部分差异表达miRNA及免疫相关基因在病原感染或LPS暴露胁迫下的的表达特征。其中miR-137表达在病原感染或LPS胁迫下呈现下调表达模式，而miR-2008、miR-31和miR-200则被诱导表达；为认识miRNA介导的刺参疾病发生分子机制，项目组构建了同批次腐皮综合症发生前后刺参体腔细胞的均一化cDNA文库和数字表达基因文库，高通量测序和生物信息学分析获得了4858个差异表达基因；完成了iTRAQ基础上的病原灿烂弧菌感染刺参过程中的体腔细胞全蛋白组的定量分析，成功注释了相关表达蛋白2049个（FDR<1.0%），筛选出差异表蛋白228个，其中129个蛋白下调表达，融合转录组和蛋白组数据，从中识别了包括miR-31、miR-2008以及miR-133等在内的miRNA的靶基因；双荧光素测定确立了miRNA-137、miR-2008以及miR-133与靶基因的调控关系；建立了刺参个体和体外培养细胞两个层次上的miRNA和靶基因功能鉴定体系，功能定性了miR-133靶向调控IRAK-1、miR-137和miR-2008分化靶向甜菜碱甲基转移酶基因的分子机制；为拓宽研究途径，项目组借助NMR代谢组学分析手段，表征了腐皮综合症刺参和灿烂弧菌感染个体肌肉组织的特征代谢产物，识别了氨基酸类，渗透调节物质，TCA循环中间物，能量代谢相关代谢物等25种高丰度代谢物，为有效衔接基因、蛋白和代谢通路提供了条件。