夏眠刺参代谢减退相关microRNAs发掘及其调控作用研究

Entry into a hypometabolic state is an important survival strategy for sea cucumber during aestivation. Clarifying the molecular mechanisms that regulate reversible transitions to and from hypometabolic states has been identified as the principal aim for aestivation regulatory research. The present project focuses on a growing area of research in hypometabolism facilitated by microRNAs.Applying high-throughput sequencing technology (Solexa), microRNA expression will be profiled in intestine and respiratory tree of sea cucumber (Apostichopus japonicus) in different stages of aestivation. Differentially expressed microRNA during aestivation and potential target genes of microRNA will be predicted. Furthermore, the temporal and spatial expression profile of key microRNAs'putative gene (protein) targets will be explored by using microarray and proteomics technology. The results will help to construct a preliminary microRNA regulation model for hypometabolic sea cucumber during aestivation.

代谢减退是刺参夏眠期间的重要生存策略之一，夏眠期间代谢减退调控机制的揭示是系统研究夏眠内在调控机理的首要问题，而microRNA的调控作用已成为代谢减退机理研究的新热点。本项目拟以刺参非夏眠期及夏眠不同阶段（深度夏眠期和夏眠解除期）的消化道和呼吸树组织为研究材料，采用SOLEXA测序技术，构建刺参microRNA文库和刺参夏眠不同阶段消化道和呼吸树组织的microRNA表达谱，筛选差异表达的microRNA，利用刺参转录组文库等信息预测靶基因；以表达谱数据库和转录组文库为基础，利用microarray和蛋白组学技术，查明夏眠过程中关键作用microRNA调控的靶基因（蛋白）的时空表达变化特征；初步构建夏眠刺参代谢减退的microRNA调控模式。

代谢减退是刺参夏眠期间的重要生存策略之一，作为代谢减退机理研究的新热点，microRNA在RNA水平对靶mRNA分子迅速有效的可逆转录调节恰好吻合代谢减退分子调节机制的需求。本研究结合Solexa深度测序技术，microRNA microarray芯片技术和stem-loop RT-PCR技术发掘了夏眠关键阶段肠道和呼吸树组织的差异表达microRNAs，预测了差异表达microRNAs的靶基因；以转录组为参考文库，结合solexa和TMT 标记结合LC-MS/MS技术查明了代谢减退相关关键基因的mRNA水平和蛋白水平的表达变化特征。将miRNA-mRNA-protein三者进行关联分析，初步预测了夏眠刺参代谢减退期间microRNA的调控模式。主要研究结果表明：肠道组织中miR-200-3p, miR-2004, miR-2010, miR-22, miR-252a, miR-252a-5p和miR-92 在深度夏眠期显著上调，上调倍数达到2-9倍，差异miRNAs靶基因的GO分析表明最显著富集的是转录相关，ATPase活性和代谢能量相关的生物过程。呼吸树组织中miR-124, miR-124-3p, miR-79, miR-9, 和miR-2010在深度夏眠期表达量显著上调。夏眠期间关键基因的表达谱分析在肠道组织各比较组中分别筛选出1245，1338和1321个差异表达基因，差异基因GO分析表明深度夏眠期比非夏眠期，有24个代谢相关的生物过程被显著富集；并筛选出代谢相关，解毒和组织保护相关以及耗能过程相关的关键差异基因。呼吸树组织各比较组中筛选出1240，1184和303个差异表达基因，深度夏眠期比非夏眠期，有两个呼吸树特异性的生物过程被显著富集：细胞周期的负调节和需氧呼吸。筛选了深度夏眠阶段肠道和呼吸树共有的以及呼吸树特有的差异表达基因。夏眠期间关键基因的蛋白表达谱分析在深度夏眠的肠道组织中筛选出143个显著上调和267个显著下调的差异表达蛋白，差异表达蛋白分析表明蛋白质和磷脂可能是刺参深度夏眠期间的主要能量来源。该结果同时揭示了刺参深度夏眠期间参与许多重要生物学过程差异蛋白的表达变化特征，包括蛋白合成，蛋白折叠，DNA结合，凋亡，细胞转运和信号，细胞骨架相关等。该项研究为深入探究差异miRNAs在刺参夏眠代谢减退期间的基因表达调控机制的研究搭建了坚实的平台。