基于可逆蛋白磷酸化层面上的南移仿刺参应答高温胁迫机制的研究

Reversible protein phosphorylation represents a key control mechanism in signal transmission and controls nearly all aspects of cellular physiology. In order to acheieve the goal to breed temperature-tolerance sea cucumber Apostichous japonicus strain in practice, the intrinsic response mechanism of sea cucumber against thermal stree was investigated focusing on phosphorylated proteins. Phosphoproteins enrichment techniques and phosphoproteomics were employed in the study and more than 10 temperature related phosphoproteins should be identified. These protein were further validated by subsequent phosphous Western blot and expression pattern analysis at mRNA level. After that, the GST fusion protein expression system was constructed and the recombinant proteins were produced in yeast cell DY150 for some vital members, and their potential binding proteins were further determined by GST pull-down assay and mass spectrometry. Combination with ongoing achievement on phosphoprotein signal pathway, phosphorylation-based signaling networks would be firstly delineated in this lower species. We hoped the present study would provide new insight into sea cucumber breeding process and unveil the mask for the species aestiviation from one aspect.

可逆的蛋白磷酸化是细胞内信号传递的关键过程，几乎调控着细胞生理过程的各个方面。本项目基于南移养殖仿刺参（Apostichous japonicus Selenka）耐高温良种培育的实际需求，以仿刺参应答高温胁迫的内在分子响应机制为突破口，借助磷酸化蛋白富集和磷酸化蛋白组学等技术手段，发掘仿刺参应答高温胁迫的相关磷酸化修饰蛋白10个以上；随后，利用磷酸化Western blot检测差异磷酸化蛋白在高温胁迫前后的表达变化，并结合其在mRNA水平上的表达情况初步确认其与高温胁迫的联系；在此基础上，筛选1-2个关键磷酸化蛋白，采用酵母体外重组和GST pull-down策略，发掘其胞内的潜在结合蛋白2-10个。最后，借鉴高等生物相关蛋白磷酸化信号通路研究进展，勾勒出仿刺参应答高温胁迫的内在调控机制雏形。该研究不仅为刺参耐高温品系的选育提供新的思路和方向，同时为人们认识刺参夏眠的内在机制提供参照。

本研究采用双向电泳和iTRAQ技术，筛选获得了适宜生长条件（16℃）和高温胁迫下（20和25℃）下刺参血细胞中差异表达蛋白和磷酸化蛋白表达谱，采用qPCR和Western blot对关键差异蛋白进行了验证;克隆获得了部分差异蛋白的全长cDNA序列，鉴定了MAPK磷酸化蛋白的互作蛋白，主要实验结果如下： .1、对适宜生长条件和高温胁迫下7天的刺参的血细胞全蛋白进行了分离，检测到约500个蛋白质点，其中表达量差异1.5倍以上且重复性较好的蛋白点27个，最大表达差异比率为5.62，成功注释了23个蛋白质点，包括Hsp60、蛋白二硫键异构酶、卵黄蛋白、ATP合酶等。GO分析揭示所获得差异蛋白主要涉及细胞骨架、物质和能量代谢、钙体内平衡和分子伴侣等功能。运用实时定量PCR技术对其中7个差异表达的蛋白在mRNA表达水平上进行进一步的评估。其中6个基因包括胶原蛋白、ATP合酶、卵黄蛋白、转铁蛋白、粘连蛋白、蛋白质二硫化物异构酶的表达水平在高温胁迫下有显著差异。其中，只有两个基因，ATP合成酶和卵黄蛋白，在蛋白和mRNA的表达水平上显示一致性。.2、在刺参高温刺激168小时的体腔液中，我们共鉴定了55磷酸化蛋白，其中43个磷酸化蛋白符合FDR < 1%。与对照组相比，有16个磷酸化蛋白存在差异表达，其中11个磷酸化蛋白含量下降，4个磷酸化蛋白含量上升。Western blot分析表明p44/42MAPK存在于刺参的体腔液，肠，肌肉和呼吸树。然而p44/42MAPK的磷酸化蛋白只存在体腔液和肌肉中。对p44/42MAPK和下游分子p90RSK的表达模式分析发现，急性升温下，他们的磷酸化水平在高温组受到抑制。而在高温持续阶段，p44/42MAPK和下游分子p90RSK的表达模式相对一致，都出现前期上调表达，后期下降甚至抑制的现象，并且不同组织表达模式有所区别。.3、利用GST pull-down技术筛选了p44/42MAPK磷酸化蛋白互作蛋白，质谱鉴定为有丝分裂激活蛋白激酶，同源热休克蛋白和谷氨酸受体互作蛋白2。.4、克隆获得了p44/42MAPK、p90RSK、葡萄糖调控蛋白GRP78和蛋二硫键蛋白等基因的全长cDNA序列，并阐明了它们在高温胁迫或病原感染下的时空表达特征。