TIMP-1在促糖尿病皮肤创面愈合中的抗凋亡作用及其机制研究

组织基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）是促进糖尿病皮肤创面愈合的重要因子。以往研究认为，TIMP-1通过抑制基质金属蛋白酶（MMPs）从而发挥其促进皮肤创面愈合的作用。然而，我们最近研究发现，TIMP-1还具有抗糖尿病皮肤角质形成细胞凋亡的作用。这一发现提示，除了"酶抑制作用"之外，TIMP-1的抗凋亡作用也是其促进糖尿病创面愈合的重要机制之一。那么，究竟是哪条信号转导通路介导了TIMP-1的抗凋亡作用，目前尚不清楚。结合文献复习及我们的预实验结果，我们提出Shc/Ras/ERK信号通路介导该过程的可能性。本项目拟进一步采取体内及体外实验证实Shc/Ras/ERK信号通路在TIMP-1抗凋亡/促创面愈合中的作用。本项目研究有望揭示 TIMP-1促进皮肤创面愈合的新机制，为确立TIMP-1作为糖尿病皮肤创面治疗的新靶点提供更充分的科学依据。

目的：探讨TIMP-1在促糖尿病皮肤创面愈合中的抗凋亡作用及其机制 .研究设计和方法：(1) 采用免疫组化检测糖尿病患者皮肤和正常皮肤创面细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达情况，同时检测TIMP-1在糖尿病和非糖尿病皮肤创面中的表达。(2) 原代培养皮肤成纤维细胞，检测重组TIMP-1(rhTIMP-1) 对糖基化终末产物（AGEs）诱导的的皮肤成纤维细胞增殖和凋亡的影响。Western blot检测凋亡相关蛋白 的表达水平。(3)腺病毒介导hTIMP-1过表达，观察其对AGEs诱导的成纤维细胞凋亡的影响。（4）制备糖尿病皮肤病变动物模型，观察腺病毒介导hTIMP-1过表达对糖尿病大鼠皮肤伤口愈合的影响。.结果：(1) 糖尿病患者皮肤角质形成细胞、成纤维细胞和炎症细胞的凋亡均明显高于正常对照组。采用TUNEL法检测糖尿病组和非糖尿病组的凋亡指数，结果表明糖尿病组凋亡指数高于非糖尿病组；糖尿病患者皮肤创面TIMP-1表达水平较非糖尿病组相比明显下降。(2) AGEs可诱导原代皮肤成纤维细胞凋亡，低浓度rhTIMP-1（1~10ng/ml）对AGEs（150ug/ml）诱导的原代皮肤成纤维细胞凋亡有保护作用。(3) 与正常对照组相比，AGEs（150ug/ml）作用使Cleaved Caspase-3 表达明显增加，rhTIMP-1（10ng/ml）使AGEs诱导的高表达的Cleaved Caspase-3的蛋白表达下降。同时，rhTIMP-1可逆转AGEs（150ug/ml）诱导的人原代成纤维细胞Bax、Bad、β-catenin、NF-κb高表达，提高Bcl-2的蛋白表达水平，抑制细胞凋亡。(4) 体内实验结果证实，糖尿病鼠伤口形成后7天, 对照组、rh-TIMP-1组、AD-EGFP组和AD-EGFP-hTIMP-1组皮肤伤口的凋亡率分别为7.31±1.03%、8.76±1.42%、12.55±3.87%和5.48±1.19%；糖尿病鼠伤口形成后14天,4组凋亡率分别为2.45±0.43%、4.39±0.64%、10.12±1.95%和1.07±0.12%，差异有统计学意义。结论：TIMP-1可通过抑制凋亡蛋白的表达，参与AGEs诱导的糖尿病皮肤成纤维细胞凋亡过程。上调TIMP-1水平可通过发挥抗皮肤成纤维细胞凋亡作用，促进伤口愈合。