LncRNA-G017745 调控MMP-9基因DNA去甲基化在糖尿病创面难愈中的作用及机制

Matrix metalloproteinases 9(MMP-9) plays a critical role in diabetic wound healing. Our previous studies have demonstrated that AGE-induced keratinocyte MMP-9 expression was linked to TET2(a subtype of DNA methylation enzyme) -mediated CpG demethylation. However, the exact mechanisms remain unknown. Then we performed RNA-Immunoprecipitation experiments and long non-encoding RNA (lncRNA) microarray analysis, and found that lncRNA-G017745 was significantly upregulated in skin tissues of both diabetic patients and rats. More importantly, it binds with TET2 directly. With the new mechanism of TET2-TDG demethylation pathway that was reported in recent literature, we speculate that lncRNA-G017745 recruit TET2, TDG and other related demethylation proteins to bind to the promoter of MMP-9. Then TET2-TDG demethylation pathway plays demethylation effect through base excision repair mechanisms and finally promotes MMP-9 expression. This will finally lead to delayed wound healing in diabetes through changing the balance between matrix deposition and degradation. The current research may help to discover the new mechanism of high MMP-9 expression in diabetic skin, and represent potential targets for drug interventions to improve diabetic wound healing.

基质金属蛋白酶9（MMP-9）高表达是导致糖尿病创面难愈的关键分子因素。我们前期研究发现：DNA去甲基化酶TET2所介导的DNA去甲基化在糖尿病MMP-9高表达中发挥重要作用，但具体机制不明。进一步的RNA-IP结合lncRNA芯片结果证实lncRNA-G017745在糖尿病皮肤组织异常高表达，且可与TET2直接结合。由此我们提出：lncRNA-G017745结合TET2并招募TDG等相关去甲基化分子，通过TET2-TDG介导的碱基切除修复机制诱导MMP-9基因DNA去甲基化，促进MMP-9的表达。本项目拟进一步采用CHIP、MeDIP-seq、启动子活性分析等方法，旨在获得lncRNA- G017745招募去甲基化蛋白定位于MMP-9启动子区、调控去甲基化的可靠证据。本项目有望揭示lncRNA影响MMP-9表达、参与糖尿病皮肤创面愈合的新机制，为糖尿病皮肤创面治疗确立新靶点提供科学依据。

研究表明，糖尿病皮肤溃疡角质形成细胞合成和分泌的MMP9水平异常高表达通过影响细胞外基质合成与降解的动态平衡参与皮肤创面难愈。进一步研究发现TET2双加氧酶调控MMP9启动子区去甲基化参与其不适当高表达过程。近年来研究发现长非编码RNA（lncRNAs）可通过表观遗传修饰调控基因的表达。因此我们猜测lncRNAs是否通过调控TET2介导MMP9启动子去甲基化从而抑制糖尿病创面愈合。.本项目在前期研究基础上，从筛选晚期糖基化终末产物（AGEs）处理后的人角质形成细胞系（HaCaT）中与TET2结合的lncRNA入手，从细胞表型、分子机制由浅入深探究lncRNA在糖尿病创面难愈中的作用及机制。本项目有望揭示表观遗传修饰调控MMP-9表达、影响糖尿病皮肤创面愈合的新机制，为将lncRNAs作为糖尿病皮肤创面治疗的新靶点提供更充分的科学依据。.本项目利用RIP-lncRNA芯片筛选出与TET2结合的lncRNAs并通过RIP-qPCR验证，筛选出lncRNA-G017745并将其命名为TET2相互作用长非编码RNA（TETILA）进行后续研究，明确该lncRNA的组织及细胞定位、基因保守性，并探讨AGEs刺激下TETILA对角质形成细胞MMP9表达调控及细胞生物学行为的影响。通过本项目的开展，我们证实TETILA在糖尿病皮肤组织中表达上调，可以增加TET2蛋白的稳定性及蛋白表达水平，介导TET2蛋白入核，进而促进TET2去甲基化酶活性。另一方面，TETILA通过促进TET2与TDG结合，形成稳定的RNA：TET2：TDG去甲基化复合物定位于MMP-9启动子区，诱导MMP-9启动子区去甲基化，激活MMP9表达，进而降解细胞外基质，抑制糖尿病创面愈合。上述研究内容为探讨lncRNAs在糖尿病皮肤病变中的作用以及阐明糖尿病皮肤病变的发病机制提供新的理论和实验依据。