bFGF对氧化应激相关酶的调控及其在促糖尿病皮肤创面修复中的作用

糖尿病皮肤溃疡的治疗是临床急需解决的重要课题之一。目前，临床已成功将外源性生长因子bFGF应用于糖尿病皮肤溃疡的治疗，并取得显著疗效。但bFGF促进创面修复的信号传递途径和网络调控作用机制尚不清楚。前期蛋白质组学实验表明bFGF可明显上调GAPDH的表达，并下调Aldolase、MDH、LDH的表达，这些蛋白均为糖代谢的关键酶，它们的表达水平或亚细胞定位又与氧化应激及细胞凋亡密切相关，进而提示bFGF可能是通过调控上述蛋白的表达或定位，来减少细胞凋亡、提高增殖能力，产生促修复作用。本课题旨在前期动物实验的基础上进一步研究bFGF对高糖损伤的成纤维细胞中GAPDH、Aldolase、MDH、LDH表达、亚细胞定位及蛋白活性的影响，以期深入探索bFGF促糖尿病皮肤修复机制与氧化应激和细胞凋亡的关系。本项研究结果不仅能在理论上指导临床，而且还可直接应用于临床。

首先，本研究通过病理学检查及蛋白质组学研究来探讨bFGF对糖尿病大鼠皮肤创面愈合的疗效。大鼠以STZ进行糖尿病造模，造模成功2个月后进行创口造模。实验动物分为N组和DM组，每组分别以自身为对照，在大鼠臀部两侧，左侧为对照组，右侧为bFGF治疗组。采用HE染色、Masson染色、免疫组化和WB等技术，综合评价bFGF对糖尿病创口愈合的情况。实验结果：（1）HE染色和Masson染色显示bFGF能促进糖尿病大鼠皮肤创口愈合。（2）免疫组化结果可见，bFGF能够加速炎症反应，促进细胞凋亡。（3）WB指标观察可得bFGF促进血管和胶原的形成、促进炎症和凋亡的发生和发展。（4）bFGF治疗机理有多方面的因素，主要涉及氧化应激、糖代谢等过程。.与此同时，构建成纤维细胞划痕损伤模型，结合RNA-Seq转录组学测序技术和WB或PCR等技术，探讨bFGF对促成纤维细胞迁移和创面修复作用的相关激活信号通路和具体的调控机制。实验结果：（1）通过细胞划痕实验我们发现外源性bFGF可显著促进细胞迁移。（2）基于RNA转录组学测序技术的应用，我们筛选除了成纤维细胞受bFGF调控的差别基因；通过KEGG Pathway数据库分析得到了一些参与调控bFGF促进细胞迁移的相关信号通路，其中包括NF-κB 信号通路、TNF 信号通路、Wnt 信号通路和Hedgehog信号通路等信号通路。（3）以细胞划痕实验为模型应用NF-κB抑制剂Bay11-7082和激动剂LPS进一步证明了NF-κB的激活抑制了成纤维细胞的迁移，相反地抑制NF-κB信号通路可促进细胞的迁移。（4）发现bFGF可抑制NF-κB激活标志性因子IκB-α磷酸化，并增加JNK的磷酸化水平，而bFGF抗体中和了内源性bFGF后明显地翻转了bFGF以上的调控作用。（5）发现Bay可激活细胞的JNK磷酸化水平，而PI3K抑制剂LY294002并不改变IκBα的磷酸化水平。（6）3D 细胞侵袭实验模型中，bFGF 和Bay11-7082均能促进细胞的侵袭作用。证明了bFGF结合FGFR受体后可通过不依赖于PI3K信号的NF-κB-JNK信号通路来调控人真皮成纤维细胞的迁移.上述实验结果为临床治疗创伤难愈性修复提供进一步的理论基础和靶向治疗。并且，本项目已发表SCI论文5篇，培养硕士研究生3名。综上所述，本项目基本完成了课题规定的任务。