基于TASCC回回甘松饮干预早期糖尿病肾病过程中肾小球固有细胞间跨越沟通的分子机制研究

Diabetic kidney disease(DKD) is seriously harm to human health.The latest study found that"tor-autophagy space coupling interval"(TASCC) is core part of podocyte injury in DKD process,and podocyte-glomerular endothelial cells cross-communication" is the main way of inrraglomerular cross-communication(ICC).We hypothesized that through podocyte’s TASCC efficient synthesis of regulatory factors,and GEC’s ICC repair GEC,thus reducing microalbuminuria,reducing cardiovascular events, relieving DKD process.Previous research found that:Based on Hui-medicine’s "FOUR-XING theory" prescription of Huihui Gansong Yin(HGY) can efficiently improve the symptoms of patients with DKD,and can reduce the plasma glucose and serum lipids in diabetic rats.To elucidate the HGY intervention the molecular mechanism of early stage DKD,our study from the Hui-medical theory,TASCC and ICC as the breakthrough point,through the establishment of DKD environment simulation method "(laminar shear stress+high glucose culture+diaphragm) in podocytes and endothelial cells as the research object,using the technology of molecular biology,laser confocal etc.,from the molecular level to observe HGY regulation TASCC and glomerular podocyte function in three signal pathways of GEC molecular mechanism and podocyte energy metabolism.

糖尿病肾病(DKD)严重危害人类健康。最新研究发现：“TOR-自噬空间耦合间隔”(TASCC)是DKD过程中足细胞损伤的核心环节,且足细胞与肾小球内皮细胞的“跨越沟通”是肾小球固有细胞间跨越沟通(ICC)的主要方式。我们推测:足细胞通过TASCC高效合成多种调控因子,与GEC进行ICC修复GEC,从而减少微量白蛋白尿,降低心血管疾病事件,延缓DKD进程。前期研究发现:基于回医“四性学说”组方的回回甘松饮(HGY)能有效改善DKD患者临床症状,并可降低DM大鼠的血糖与血脂。为阐明HGY干预早期DKD的分子机制,本课题从回医理论出发,以TASCC及ICC为切入点，通过建立“DKD环境模拟法”（层流剪切应力＋高糖培养＋隔膜）,以足细胞和内皮细胞为研究对象,运用分子生物学、激光共聚焦等技术,从分子水平观察HGY调控TASCC及肾小球足细胞作用于GEC的3个信号通路的分子机制及足细胞能量代谢途径。

糖尿病肾病(DKD)严重危害人类健康。最新研究发现：“TOR-自噬空间耦合间隔”(TASCC)是DKD过程中足细胞损伤的核心环节,且足细胞与肾小球内皮细胞的“跨越沟通”是肾小球固有细胞间跨越沟通(ICC)的主要方式。前期研究发现:基于回医“四性学说”组方的回回甘松饮(HGY)能有效改善DKD患者临床症状,并可降低DM大鼠的血糖与血脂。为阐明HGY干预早期DKD的分子机制,本课题从回医理论出发,以TASCC及ICC为切入点，通过建立“DKD环境模拟法”（层流剪切应力＋高糖培养＋隔膜）,以足细胞和内皮细胞为研究对象,运用分子生物学、激光共聚焦等技术,从分子水平观察HGY调控TASCC及肾小球足细胞作用于GEC的分子机制。研究结果发现：（1）在高糖（33.3mM/L）条件下，培养小鼠肾足细胞，运用Western blot法，观察0h、2h、6h、12h、48h时点，Beclin1、LC3(Ⅰ/Ⅱ)的蛋白含量（±BafilomysinA1），确定：足细胞中发生了自噬现象；（2）在模拟DKD环境下，即：将高糖培养的小鼠动脉内皮细胞置于定轨振荡器（10dyn/cm2）震荡，分别于0h、6h、12h、24h、32h、48h、72h、80h各时点将细胞培养液经半透膜滤过后，加入高糖培养的小鼠肾足细胞（培养0h、6h、12h、24h、32h、48h、72h、80h）中。运用Western blot法，检测Cyclin A、LC3(Ⅰ/Ⅱ)；p-Akt（T308）、p70-S6K；Atg1、ULK的蛋白含量，确定：DKD环境下，足细胞早期自噬时段为0-12小时。（3）在模拟早期DKD环境下，提取其足细胞培养液，经半透膜滤过，加入高糖培养且置于定轨振荡器（10dyn/cm2）震荡的小鼠动脉内皮细胞中，运用Western blot法，测定干预后各组内皮细胞中的信号通路蛋白的变化：1）通过TGFβ/ Smad信号通路：HGY能够下调TGFβ、上调TGFβ RII、上调COL1A1蛋白含量、上调p-Smad2、 p-Smad3蛋白磷酸化活性；2）通过mTOR信号通路：HGY能够下调mTOR、AKT、Rheb、ULK1，上调TSC蛋白含量。验证了：HGY能通过TASCC途径，促进足细胞分泌相关蛋白，通过调控足细胞与GEC的跨越沟通，改善DKD环境下肾小球功能，进而在早期DKD阶段恢复肾小球稳态.