基于自噬-内质网应激-凋亡信号偶联网络研究回回甘松饮干预早期糖尿病肾病的作用机制

Diabetic nephropathy (DN) is a serious hazard to human health disease. On the pathogenesis of DN process, autophagy-endoplasmic reticulum stress (ERS)-apoptosis signal coupling network decides the fate of the renal inherent cells. It is an important mechanism of DN. Keeping the renal inherent cells homeostasis is a new control target in DN. Early discovery: based on the theory of ‘FOUR XING’ of Hui medicine, Hui-hui Gan-song Yin (HGY) effectively protects early DN rats by miR-192 mediating TGF-beta1/Smads signal pathway. TGF-beta1 participated in the renal regulation of both autophagy and ERS, while miR-192 participated in the kidney cells apoptosis regulation. We have reasons to speculate: HGY has certain regulation effects for the autophagy-ERS-apoptosis signal coupling network to DN. This subject proposed to observe the efficacy of HGY by db/db mice; to observe the efficacy of the serum of HGY on four kinds of renal inherent cells by the high concentration of glucose induced; to observe the regulation of HGY on targets of autophagy-ERS-apoptosis signal coupling network in the mechanism of the early stage of DN, using molecular biology, flow cytometry, confocal laser technology, from animal- tissue-cellular-molecular levels, making every effort to provide new way for prevention and treatment of DN.

糖尿病肾病（DN）是严重危害人类健康的疾病。在DN发病过程，自噬-内质网应激（ERS）-凋亡信号偶联网络决定了肾脏固有细胞的命运，是DN发生、发展的一个重要机制。保持肾脏固有细胞内环境稳态是治疗DN的一个新靶点。前期发现：基于回医“四性学说”组方的回回甘松饮（HGY）能够调控miR-192介导的TGF-β1/Smads信号通路保护早期DN大鼠肾脏。而TGF-β1和miR-192均参与了肾脏自噬-ERS-凋亡信号偶联网络的调控过程。我们有理由推测：HGY对于肾脏自噬-ERS-凋亡信号偶联网络具有一定的调控作用。本课题拟通过db/db小鼠，观察HGY对早期DN小鼠的药效；通过高糖诱导四种肾脏固有细胞，观察HGY含药血清的作用；运用分子生物学、流式细胞术、激光共聚焦技术，从动物-组织-细胞-分子水平，观察HGY调控自噬-ERS-凋亡信号偶联网络多靶点干预早期DN的作用机制，为防治DN提供新思路。

目的：验证回回甘松饮对高糖条件下肾小球系膜细胞、肾小球内皮细胞、足细胞和肾小管上皮细胞的早期保护作用,探讨回回甘松饮通过调控系膜细胞中相关自噬信号通路以及内皮细胞中相关自噬信号通路以改善肾小球损害的分子机制,为早中期糖尿病肾病的发病机制及治疗靶向提供新思路.方法:选用永生系小鼠肾小球系膜细胞、肾小球内皮细胞、肾小管上皮细胞和足细胞,将四种细胞各分为3组，予以空白血清和回回甘松饮含药血清干预，采用CCK-8法分别检测不同含药血清对高糖诱导的四种细胞活力的影响。采用流式细胞术检测SV40 MES 13和MGECs细胞的细胞周期以及四种细胞内ROS；采用MDC荧光染色法检测四种细胞自噬发生率；分别采用蛋白质印迹法技术，检测系膜细胞中（TIMP3、STAT1和FoxO1蛋白）和内皮细胞中（TGF-β1和BAMBI蛋白）以及LC3和p62蛋白的表达。结果：CCK-8结果显示：与模型组相比，HGY给药组对肾小球系膜细胞、肾小球内皮细胞、肾小管上皮细胞的增殖有一定抑制作用（P<0.01）。细胞周期结果显示：与模型组各期相比，HGY高剂量组可使系膜细胞发生G1/S期阻滞（P<0.01）。流式细胞术检测细胞内ROS显示：HGY高剂量组ROS水平低于模型组（P<0.01）。MDC染色法观察自噬发生率：HGY高剂量组荧光强度及数量高于Mod组（P<0.01）。HGY可以通过调控高糖条件下的系膜细胞和内皮细胞内自噬相关蛋白，促进自噬发生，改善肾损害进程。Western blot结果显示：与模型组相比HGY组LC3表达量显著高于模型组（P<0.01），p62表达量低于模型组（P<0.01）；与模型组相比TIMP3、STAT1、FoxO1蛋白表达量下降（P<0.05）；HGY组TGF1表达量下降（P<0.05），BAMBI蛋白表达升高（P<0.05）。结论：HGY对高糖状态下肾小球系膜、内皮细胞、肾小管上皮细胞和足细胞早期有保护作用。HGY通过下调SV40 MES 13细胞中TIMP3、 STAT1、FoxO1蛋白的表达，激活TIMP3-STAT1- FoxO1通路促进系膜细胞自噬的发生，改善肾小球损害。HGY通过上调MGECs细胞中BAMBI的表达，下调TGF-β1，激活TGF-β1-BAMBI通路促进细胞自噬，减轻肾小球损害。