以p16Ink4a基因为靶点回回甘松饮延缓胰岛β细胞衰老的分子机制研究

宁夏回族2型糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）发病率高且以老年性DM为主。2009年美国糖尿病学会(ADA)年会最新提出：p16Ink4a表达水平可作为衡量胰岛β细胞衰老的生物学金指标。据此，基于回医"四性体质学说理论"及相关前期临床和实验研究结果，推测：回医古方- - 回回甘松饮(HGY)延缓胰岛β细胞衰老的主要作用靶点很可能是p16Ink4a及相关调控基因。本研究将主要以老年性DM大鼠为对象，运用RT-PCR及Western-blot分子生物学方法，进一步研究HGY对老年性DM大鼠的p16Ink4a、Bmi-1及Ezh2基因mRNA及蛋白表达的影响，从而验证"HGY通过p16Ink4a及其相关调控基因延缓胰岛β细胞衰老"的假说，阐明HGY作用的新靶点。该研究为寻求治疗宁夏回族2型DM有效回药复方提供科学依据，对宁夏回族2型DM的防治及回族特色医药、保健品的开发具有重要意义。

本项目按照计划任务书已经如期按时完成。具体情况如下：目的：宁夏回族2型糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）发病率高且以老年性DM为主。p16Ink4a表达水平可作为衡量胰岛β细胞衰老的生物学金指标。在以往对回回甘松饮(HGY)的相关研究基础上，本课题以老年性DM大鼠为实验对象，旨在验证“HGY可能通过调控p16Ink4a及其相关通路延缓胰岛β细胞衰老”的假说，阐明HGY治疗DM的新靶点。方法：（1）制备动物模型：选用Wistar老年大鼠150只，以脂肪乳灌胃10d后，ip.注射四氧嘧啶100mg/kg，15min后ip.胰岛素0.4U，次日再ip.四氧嘧啶80mg/kg，其他操作同第前。以72h后两次随机血糖≥16.7mmol•L-1，为DM模型复制成功的标志。将造模成功的大鼠随机分为4组：模型组(Model)、HGY（20g•kg-1）组(H-H)、HGY（10g•kg-1）组(H-M)、HGY（5g•kg-1）组(H-L)，每组25只。连续给药4周（24月龄）。另设老年对照组（Old）25只。在末次灌胃给药后1小时，腹主动脉取血，分离血清并留存。（2）提取胰岛β细胞：各组大鼠麻醉后，结扎侧胆总管，放血处死。分离胰腺，消化，使呈细沙状后终止消化，过滤、洗涤、离心后得到胰岛的初步制备物。用荧光激活流式细胞分选（FACS）检测，分选获得的β细胞用于检测。（3）作用机制研究：在基因水平上，采用实时荧光定量PCR方法检测大鼠胰岛β细胞p16Ink4a、Bmi-1及Ezh2 mRNA的表达水平；在蛋白水平上，采用Western Blot方法检测大鼠胰岛β细胞p16Ink4a、Bmi-1及Ezh2的表达水平。结果：HGY能够在基因水平上上调Bmi-1及Ezh2 mRNA的表达，下调p16Ink4a mRNA的表达，具有显著性差异（vs.模型组，P＜0.01或0.05）；在蛋白水平上上调Bmi-1及Ezh2的表达，下调p16Ink4a的表达，具有显著性差异（vs.模型组，P＜0.01或0.05）。结论：HGY在大鼠胰岛β细胞中可能通过调控p16Ink4a介导的Bmi-1及Ezh2相关的信号通路延缓DM大鼠胰岛β细胞的衰老进程。取得成果：申请发明专利1项（已公开），培养研究生4名，发表中文核心期刊论文1篇，培养中青年骨干教师4名。