以miR-21为主靶点回回甘松饮干预糖尿病ZDF大鼠肾纤维化及肾小管上皮细胞转分化机制研究

Diabetes mellitus (DM) due to renal fibrosis (RF) is a disease of serious harm to human health, the exact mechanism has not been elucidated. miR-21 is an important regulator of TGF-β1-induced tubular epithelial - mesenchymal transdifferentiation (EMT), and is an important node of the PTEN / PKB / Akt pathway. We speculate: miR-21 can effectively regulate PTEN / PKB / Akt signal pathway, which may be the RF onset of a new mechanism. Preliminary studies have been found: hui-hui gan-song yin (HGY) based on the" four doctrines theory of Hui-Yi can reduce DM animal models of blood sugar and blood lipids,improve the Ningxia Hui diabetic nephropathy (DN) in patients with symptoms effectively.On this basis, in order to clarify the HGY efficacy and molecular mechanisms of early and mid RF, the subject to be adopted by the RF model in rats, observed HGY pharmacodynamic. The use of technologies such as molecular biology, flow cytometry, from whole - cells - the molecular level, to observe HGY main target of miR-21 regulation of PTEN / PKB / Akt signal pathway, to improve the mechanism of the early and mid RF. The subject starting from the Hui -Yi theory, miR-21 as the starting point, to clarify HGY efficacy and mechanism of RF, providing new ideas for combating RF.

糖尿病(DM)所致肾纤维化（RF）严重危害人类健康,其确切机制尚未完全阐明。miR-21是TGF-β1诱导肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）的重要调节因子,并且是PTEN/PKB/Akt通路的重要节点。我们推测：miR-21可有效调控PTEN/PKB/Akt通路，这将成为RF发病的一个新机制。前期研究发现：基于回医"四性学说"理论组方的回回甘松饮（HGY）有效改善糖尿病肾病患者临床症状；并可降低DM大鼠的血糖与血脂。为阐明HGY对RF的药效及机制，本课题拟引入ZDF大鼠模型，观察HGY药效。运用分子生物学、激光共聚焦等技术和手段，从动物-细胞-分子水平，以miR-21为主要靶点，观察HGY调控PTEN/PKB/Akt信号通路干预糖尿病ZDF大鼠早中期RF及干预肾小管上皮细胞EMT机制。本课题从回族医学理论出发，以miR-21为切入点，阐明HGY对RF的药效及机制，为防治RF提供新思路。

目的：证实HGY对早中期肾纤维化大鼠的保护作用，并揭示HGY以miR-21为主靶点，通过与靶基因PTENmRNA特异性结合，调控PKB/Akt信号转导通路，改善早中期肾间质纤维化，揭示其保护早中期肾纤维化大鼠的分子机制，为肾纤维化的防治提供新思路和新靶点，为寻求治疗宁夏回族DM的回药复方提供科学依据。.方法：1.利用糖尿病ZDF大鼠成功构建DM早中期肾纤维化模型（6周龄ZDF鼠饲喂8周），再分别给予HGY及阳性对照药蒙诺干预后，观察大鼠的一般状况、肾指数；检测血尿素氮、血肌酐、血糖、糖化血红蛋白、24小时尿蛋白、血脂等生化指标；观察肾脏组织形态、病理变化。通过上述指标证实：HGY对糖尿病ZDF大鼠早中期肾纤维化的保护作用。2.采用Western Blot技术，观察FN、ColⅠ、TGF-β1、PTEN、PKB/Akt蛋白在大鼠肾组织中的表达情况；采用RT-PCR技术，观察miR-21及PTENmRNA在大鼠肾组织中的表达情况。3.高糖培养肾小管上皮细胞（NRK-52E），采用MTT法测定各组细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期，观察HGY对NRK-52E及细胞周期的影响。采用酶联免疫吸附法（ELISA）法检测各组NRK-52E培养上清FN、ColⅠ、TGF-β1、PTEN、PKB/Akt含量；采用RT-PCR技术，观察NRK-52E细胞中miR-21及PTENmRNA的基因表达情况。.结果：（1）动物实验：HGY能够调节血糖、血脂水平，降低尿量及肾指数，减轻肾脏病理变化，并能够在蛋白和基因水平上调节肾组织中FN、ColⅠ、TGF-β1、PTEN、PKB/Akt、miR-21的表达，与模型组比较具有显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）。（2）细胞实验：HGY含药血清能够抑制高糖诱导的NRK-52E增殖，调节细胞周期比例，并能够在蛋白和基因水平上调节NRK-52E中FN、ColⅠ、TGF-β1、PTEN、PKB/Akt、miR-21的表达，与高糖组比较具有显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）。.结论：HGY以miR-21为主靶点，通过与靶基因PTEN mRNA特异性结合，调控PTEN/PKB/Akt信号转导通路，改善早中期肾间质纤维化。