DNA甲基化与相关基因表达在迟发性运动障碍发病机制中的作用

Tardive dyskinesia (TD) is a serious side effects induced by the long-term administration of antipsychotics, which was high incidence and potentially irreversible and disable. The pathophysiology and the well-accepted treatments remain unclear. So this disorder severely affected the compliance and rehabilitation of patients. Accumulated evidence suggested that TD might result in genetic susceptibility and neuroleptic-exposure and their cross-talk. In this study, we speculate that DNA methylation antipsychotic-induced might play an important role in onset and progression of TD. In this project, the schizophrenic patients with and without TD and healthy volunteers would be enrolled by using case-control method. The whole-genome DNA methylated patterns of TD patients would be characterized by using the methylated DNA immunoprecipitation and high-throughput DNA methylation sequencing, moreover, the state of methylation in 10-14 differentially methylated genes would be tested by using methylation specific polymerase chain reaction (MSPCR). Furthermore, to confirm the results of DNA methylation sequencing by using the MSPCR and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for expression of 6-8 differentially methylated genes in a larger sample size. The canditated gene may be screened by analyzing the correlation of abnormality of DNA methylation and expression. The results of present study might provide new evidence of the pathogenesis of TD and biomarkers for prediction, diagnosis, treatment and prognosis of TD.

迟发性运动障碍（TD）是长期服用抗精神病药物所致运动系统副作用，发生率高，致残性明显。发病机制尚未阐明，仍无有效治疗手段，严重影响患者治疗依从性和康复。有研究提示，个体易感与药物暴露共同导致TD发生。本项目假设抗精神病药物诱导的DNA甲基化在TD发生过程中作用关键。本课题以TD和非TD患者、健康对照为研究对象，应用全基因组甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-seq），构建TD患者全基因组DNA甲基化谱；扩大样本量，应用甲基化特异性聚合酶链反应（MSPCR）验证10-14个甲基化最显著基因的甲基化情况；进一步扩大样本量，在验证测序结果的同时，运用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测筛选出的6-8个甲基化差异最显著的基因的表达水平，分析DNA甲基化、基因表达异常与TD的关联，旨在筛选出TD候选基因。本研究实施可筛选出TD异常甲基化基因，为TD预测、预防和新治疗手段的开发提供可靠依据。

现有的证据显示，迟发性运动障碍（tardive dyskinesia，TD）是由长期服用抗精神病药导致的临床上较为常见的药物不良反应，具有发生率高、致残性明显、严重影响患者治疗依从性和康复的特点。近年来对TD的发病机制探索并无直接证据，难于为疾病的防治提供依据。基于以上问题，本研究一方面通过采用甲基化 DNA 免疫共沉淀联合高通量测序（Methylated DNA immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing，MeDIP-Seq）技术，以TD、非TD和健康对照为研究对象，系统地建立了TD 和非TD患者的全基因组甲基化谱，并初步检测出TD患者差异化甲基化基因；然后使用焦磷酸测序方法进行验证，结果发现CYP2E1、ISR1和DLGP2基因差异甲基化与TD患者存在关联，此三个基因功能分别与抗精神病药物的代谢、线粒体自由基氧化代谢、神经营养等功能关系密切，从而基本验证了本研究提出的TD与表观遗传中的DNA甲基化有关假说；最后通过实时荧光定量PCR技术（Real-time fluorescence quantification PCR， RT-PCR）检测差异甲基化基因的mRNA表达水平发现TD组与非TD组存在差异表达的目的基因为CYP2E1, 且该基因mRNA在TD组的表达水平显著高于非TD组。结合前人研究结果提示CYP2E1能够通过药物和污染物代谢形成的大量活性代谢产物产生的氧化应激会引起线粒体的功能障碍。CYP2E1酶的活性越低其产生的线粒体功能障碍的严重程度越小。通过本项目的实施，为完善TD的发病机制提供了良好的理论依据，而且为疾病的防治提供了新的思路。此外，本项目还采用神经心理学和神经影像学的方法以期为TD患者神经元变性假说提供依据。具体来说，通过对TD患者的临床特征进行探索发现：与非TD患者相比，TD患者认知功能下降明显；结构磁共振的结果提示，TD患者楔叶、舌回的灰质体积下降，而且与疾病的严重程度相关。功能磁共振的低频振幅研究发现：TD患者在静息状态下存在脑自发性神经活动异常，以枕上回和楔叶较为显著，功能连接研究发现TD患者存在三角部中央后回和额下回的功能障碍。