细胞粘附蛋白的单分子操纵研究

Cells attach to each other to form tissues and organs through cell-adhesion proteins. Cell-adhesion proteins not only function as cross-linkers, but also work as force sensors to help cell sense their surrounding mechanical environment. Single molecular manipulation techniques can control stretching force on single protein molecule precisely, and measure the extension of single protein with high spatial resolution of nanometers, which makes such methods the most proper experimental techniques to study the force response of cell-adhesion proteins. In this proposal, we will simulate the biological process when cell is stretched by mechanical force by using single molecular manipulation technique magnetic tweezers. Single purified cell-adhesion protein will be stretched and the force-dependent conformation transition and interaction will be studied. The main aims and contents of the proposed project include: (1) study the stability, force-dependent conformation transition, and folding/unfolding dynamics of cell-adhesion proteins β-catenin and P120ctn; (2) study force-dependent interaction between intracellular domain of E-cadherin and β-catenin; (3) study the entropic elasticity of intrinsic disordered protein and its conformation transition induced by protein-binding. This project will disclose the molecular mechanism of mechanical sensing function of cells through quantitative single molecular force manipulation and measurement of cell-adhesion proteins.

细胞粘附蛋白将不同细胞结合在一起构成生物组织与器官，它们不仅具有交联的功能，也是细胞感知环境力学信号的传感器。单分子操纵技术可以精确地控制作用在单个蛋白分子上的拉力并以纳米精度测量蛋白的伸长变化，是研究细胞粘附蛋白的力学响应的最适合的实验手段。本项目将利用磁镊单分子操纵技术，模拟细胞在受到外力拉伸时的生物过程，对单个细胞粘附蛋白进行力学拉伸，来研究拉力依赖的蛋白构象变化和相互作用的变化。本项目的主要研究目标和研究内容包括：（1）研究细胞粘附蛋白β-catenin，P120ctn的稳定性、拉力导致的构象转变和折叠/去折叠的动力学过程；（2）研究细胞粘附蛋白E-cadherin的胞内结构域与β-catenin蛋白之间相互作用与所受拉力的依赖关系；（3）研究固有无序蛋白的熵弹性和结合诱导的构象转变过程。本项目的意义在于通过在单个蛋白分子水平上的精确力学操纵和测量来揭示细胞力学传感的分子机制。

细胞通过细胞粘附蛋白结合在一起或与胞外基质结合构成生物组织与器官。这些蛋白稳定的三维结构决定了它们与不同分子的可调控的动态结合解离过程，进而完成其特定的生物功能。由于细胞粘附蛋白在体内环境中会受到机械外力的作用，因而其对外加拉力的响应也非常重要。本项目利用磁镊单分子操纵技术，对单个蛋白质分子进行力学拉伸，来研究在拉力作用下蛋白质发生去折叠转变，以及拉力减小后重新折叠的动力学过程。由于磁镊技术可以精准地控制蛋白分子上的恒定拉力，并测量在该拉力下的构象转变速率，这样得到的拉力依赖的构象转变速率可以用来分析蛋白折叠的自由能曲面。..本项目的主要研究对象包括在细胞间粘附中起到重要功能的连接蛋白beta-Catenin，它直接与胞间粘附膜蛋白E-Cadherin相连接，并且进一步通过alpha-Catenin等蛋白连接到细胞骨架微丝蛋白上。我们得到了beta-Catenin在拉力作用下的去折叠动力学过程，并且研究了它与E-Cadherin的胞内结构域之间的结合与解离过程，发现beta-Catenin的磷酸化可以对二者间的相互作用进行调控。..本项目的另外一个研究对象是胞外基质蛋白Fibronectin，它的一个结构域Fibronectin III-10与细胞上的膜蛋白整合素相结合，是细胞与胞外基质连接的重要蛋白。在磁镊单分子实验中，我们通过对一系列截断突变体的测量，确定了去折叠中间态的具体构象。我们测量了拉力依赖的自然构象与中间态构象之间的转变速率，以及中间态与完全去折叠构象之间的转变速率，并据此得到了Fibronectin III-10完整的自由能曲面。..为了更方便地进行单分子操纵研究，在项目中我还设计了蛋白质标签Spycatcher和Spytag的特定连接方式，这种连接方式在30皮牛拉力下可以给出平衡态的局部折叠与去折叠转变，不仅可以为单分子力谱测量提供通用的指纹信号，还可以对拉力大小进行校准。另外，在本项目的支持下，我们还对几种典型的模型蛋白的折叠与去折叠动力学进行了测量，包括GB1、冷休克蛋白CSP、酰基磷酸酶Acylphosphatase (AcP)、src SH3等。力谱测量的实验结果帮助我们构造了它们的自由能曲面，加深了对蛋白质折叠过程的物理理解。