细胞粘附蛋白解折叠的单分子力谱研究

Cell adhesion mediated by speci?c cell surface molecules plays a pivotal role in life sciences. Cellular communication, tissue development, in?ammation, cancer and microbial infection are just a few examples of cellular processes regulated by cell adhesion molecules. Adhesion of C. albicans yeast cells to host tissues is a key factor in the maintenance of commensal and pathogenic states, which is mediated by a family of cell surface proteins known as the agglutinin-like sequence (Als) proteins. Of the Als proteins, the cell-cell aggregation is mainly participated by a tandem repeat (TR) region. Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy (SMFS) is a very effective technique for the investigation of inter- or intramolecular interactions at sinlge molecule level. In this project, we firstly want to stretch and relax the TR region of Als protein on the surface of living cell repeatly to detect whether the unfolding structure can go back to its folding state. If this unfolding-folding process is reversible, we want to use the force-clamp mode of SMFS techniques to record the unfolding-folding trajectory of TR region as a function of time, and to investigate the foce-dependence of duration for folding collapse. For the mechanical unfolding is a force-dependent process, we plan to stretch the protein under different constant forces to measure the unfolding probability distribution function with time, ?t the distribution by a single exponential function to obtain the time constant, and then get the rate constant under each pulling force. Finally, the rate constant as a function of pulling force is plotted to calculate the dynamic parameters with the combination of Arrhenius equation, and the energy landscape of protein unfolding process is described.

利用特殊的细胞表面分子产生细胞粘附作用在生命科学领域中是具有重要地位的。致病菌白色念珠菌依靠其表面的一种Als蛋白与宿主细胞进行粘附，而粘附作用主要依靠蛋白中的TR区域。基于原子力显微镜的单分子力谱技术是一种有效地在单分子水平上研究分子间/分子内相互作用的方法。本项目中，我们首先欲利用单分子力谱技术对活体细菌表面的TR区域进行往复拉伸，从而探测解折叠的蛋白是否可以重新折叠回去。若该过程可逆，欲利用单分子力谱中的力钳模式记录TR区域解折叠-折叠随时间变化的轨迹，并探测折叠过程中所用外力对折叠停留时间的影响。蛋白的解折叠过程是具有拉力依赖性的，欲通过在不同的恒定力值下对TR区域进行拉伸，从而测得解折叠概率随时间变化的函数以及每个恒力下的速率常数,并结合Arrhenius方程计算出解折叠的动力学参数并绘制其能垒图。

烟草花叶病毒(TMV)是一种管状病毒，其管长300 nm。蛋白外壳由2130个蛋白亚单元（即衣壳蛋白）组成。TMV的遗传物质是一条单链RNA，含有6390个碱基，RNA通过与衣壳蛋白的相互作用盘绕在病毒的螺旋状内壁上，每一个衣壳蛋白与三个核苷酸相结合。研究表明，RNA与衣壳蛋白之间主要依靠静电相互作用和疏水作用等结合，含有AAG特殊序列的RNA与衣壳蛋白之间具有更强的结合能力。烟草花叶病毒是最早被发现的病毒，是研究生物大分子组装、解组装的理想模型体系。通过利用基于原子力显微镜的单分子力谱方法，基因组RNA与衣壳蛋白之间的结合强度已经被测量，并且TMV的组装、解组装过程也得到了初步的探测。但关于TMV的侵染机制仍缺乏直接的实验数据的支持。因此，揭示病毒侵染机制并且最终实现对它的调控在生物学领域具有十分重要的意义，同时也为植物的有效保护以及崭新的抗病毒药物的开发奠定坚实的基础。.本项目通过将pH值从4.7变化至7.0来模拟TMV进入细胞之后的侵染过程，从而探测其侵染机制。首先，我们测量了在10个不同加载速率下的RNA与衣壳蛋白之间的断裂力，获得了RNA与衣壳蛋白复合物的动态力学谱。RNA与衣壳蛋白的解离过程在实验所用速率范围内具有加载速率依赖性，说明该解离过程是不可逆的耗散过程。通过计算得出该复合物在不受外力的平衡状态下的一些动力学参数，如解离速率常数koff、平均寿命τ、结合态到过渡态的距离xβ等。在pH值为4.7的条件下，RNA与衣壳蛋白的解离由一个能垒控制，对应的是结合态到过渡态的距离分别为0.06 nm和0.072 nm的RNA与衣壳蛋白的近程识别作用；在pH值为7.0的条件下，RNA与衣壳蛋白的解离由两个能垒控制并经过一个中间态。除了由与pH值为4.7的条件下类似的识别作用控制之外，还受到无序的突环结构对RNA解离的阻碍作用控制。其次，我们第一次通过力钳模式将RNA的拉伸长度随时间变化的轨迹实时地记录下来。两个断裂位点之间RNA的完全伸展长度为4.2 nm，在解组装过程中RNA从蛋白外壳上每一步同时打开两个蛋白位点。