外力作用下蛋白质折叠与去折叠的单分子操纵研究

Cells sense their surrounding mechanical environment through force-sensing proteins and generate different response, such as differetiation and migration. The force-dependent folding and unfolding processes of force-sensing proteins are not only an important physical problem, but also have important biological functions. In this proposal, we are going to study the folding and unfolding properties the important muscle protein Titin and cytoskeleton protein Filamin A when they are subject to physiological forces and force-dependent interactions with their binding partners by using magnetic tweezers single molecular manipulation technique. Most other techniques are not able to do similar studies. The main aims and contents of the proposed project include: (1) Measure the force-dependent unfolding rate and folding rate to study the unfolding and folding processes of proteins when they are subjected to physiological forces; (2) Under critical force, the equilibrium folding and unfolding dynamics will be measured over long time to get the free energy landscape of protein folding; (3) The dependence of protein folding/unfolding properties on environment conditions like tempereature and salt concentration will be studied, and main driving force of protein folding will be determined; (4) Explore the force-dependent protein interactions. In addition to disclosing the general properties of protein folding and unfolding, the project will shed light on the functional mechanism of force-sensing proteins in the cell.

细胞依靠力学传感蛋白感受外部力学环境的变化而产生不同的生物学响应，如细胞分化与迁移等，因此力学传感蛋白在外加拉力作用下的去折叠/折叠过程不仅是个重要的物理问题，也具有重要的生物功能。本项目以重要的肌肉蛋白Titin和细胞骨架蛋白Filamin A为研究对象，利用磁镊单分子操纵技术来研究在生理条件拉力作用下蛋白质折叠与去折叠的性质，这类研究是目前绝大部分实验技术所不能实现的。本项目的主要研究目标和内容包括：（1）研究蛋白质在恒定拉力下的去折叠与折叠过程；（2）通过对蛋白质在临界拉力作用下折叠与去折叠转变的平衡态测量确定蛋白质折叠的自由能曲面；（3）研究蛋白质折叠与去折叠过程对温度、盐浓度等环境因素的依赖关系，确定蛋白质折叠的主要驱动力；（4）探索拉力对蛋白质之间的相互作用的影响。本项目不仅可以阐明蛋白质折叠与去折叠的一般物理规律，也将揭示细胞中的力学传感蛋白行使生物功能的分子机制。

绝大多数蛋白质执行其生物功能的前提是它能够从多肽链折叠到其特定的三维结构，而蛋白质的降解需要将将其解开成多肽链构象才可以进行，所以蛋白质的折叠与去折叠的研究具有重要的生物学意义，可以认为是生物中心法则 的重要延伸。近些年来，人们进一步发现蛋白质在体内的输运和行使功能的过程中也伴随着构象转变甚至完全去折叠后再重新折叠的动力学过程，特别是肌肉纤维和细胞骨架的相关蛋白质，它们在周期性拉力的作用下会发生去折叠与再折叠的转变，同时通过拉力导致的构象转变与相互作用的变化来帮助细胞感受外界力学环境的变化而做出相应的反应。.本课题的主要研究了肌肉蛋白和细胞骨架蛋白在拉力作用下的折叠与去折叠的自由能变化和动力学过程。通过自主研发搭建的磁镊单分子操纵设备，实现了对于单个蛋白质的长时间高精度的平衡态与非平衡态的测量。由于磁镊无需反馈控制就可以可以实现恒定拉力的测量，我们可以精确的测量从2 pN到100 pN以上的拉力范围内蛋白质折叠与去折叠的响应。.测量得到的最主要结果首先是确认不同蛋白质折叠与去折叠过程所经历的不同状态，我们发现 titin I27可以用简单的两态模型来描述，而细胞骨架蛋白 alpha-catenin 在去折叠过程中，M2-M3结构域去折叠过程中会经过一个中间态。其次，我们可以在单个蛋白质上得到蛋白质折叠与去折叠速率对拉力的准确依赖依赖关系。我们发现titin I27在拉力小于25 pN时，其去折叠过程出现反常的拉力依赖关系，拉力越小，其去折叠速率反而越快。这是在蛋白质去折叠领域首次发现的catch bond现象。我们建立了一个具有高度熵弹性的过渡态模型，可以对我们的实验结果进行完美的解释。这是一种全新的catch bond现象的模型。.另外，我们也对GB1， CSP等几种蛋白质的折叠与构象转变过程进行了研究。关于生物大分子间的相互作用，我们发现spycatcher和spytag形成的复合体局部可以发生unzipping的构象转变，CSP和寡聚核苷酸可以发生相互作用并使得CSP稳定性提高。