利用TALEN进行果蝇基因组大片段DNA knock-out与knock-in新技术的建立及其应用

The TALEs (transcription activator-like effectors) are a family of proteins that were first discovered in the plant pathogen Xanthomonas sp., containing a central conserved, but sequence specific DNA binding domain, which usually consists of 17.5 tandem repeats of a 34 amino acids monomer. The tadem repeats specifies the DNA binding specificity by its 12th and 13th repeat variable di-residues (RVDs). Upon the fusion of the customized DNA binding domain of　a TALE and the enzymatic active domain of the FokI nuclease, TALEN can be directed to any selected target of the genome to yield a double-strand break (DSB). Using these TALENs, we have for the first time targeted the yellow and the fio genes in Drosophila with high efficiency and specificity. We aim to establish a new technique by which we can use TALEN to efficiently carry out the knock-out and knock-in of the large fragment DNA in Drosophila genome. With the established techniques, we are going to study the mechanistic relationship between repetitive DNA sequence and heterochromatin formation/maintenance.

TALE（transcription activator-like effector）是最初发现于植物病原菌Xanthomonas sp. 中的一类DNA结合蛋白，具有高度保守的DNA结合结构域。每个DNA结合结构域通常包含17.5个（共4种，分别识别A、T、C、G）串联排列的重复单元。这些重复单元的不同排列组合决定了TALE蛋白的DNA结合特异性。TALEN（TALE nuclease ）是TALE DNA结合结构域与核酸内切酶FokI功能结构域的融合蛋白，兼具DNA结合特异性和核酸内切酶活性，人工设计TALEN几乎可以使得在果蝇基因组任意位点产生DNA双链断裂成为可能。本项目探索建立利用TALEN在果蝇体内实现DNA大片段knock-out与knock-in的新技术,并以此为基础研究DNA重复序列与异染色质形成及维持的关系。

本项目经过三年的探索研究，进展基本顺利。首先，我们按原计划，首次利用TALEN对果蝇基因组进行精确的DNA片段敲入与敲除，为TALEN的深入应用奠定了基础。我们系统阐述了CAF-1通过与特定的表观遗传调节因子相互作用，在多细胞生物发育过程中在异染色质形成、细胞不对称分裂及染色体表观遗传学调控介导的信号转导过程中发挥的重要作用。其次，我们利用本实验室建立的果蝇CRISPR/Cas9系统，对果蝇基因组进行精确敲入。通过系列实验，我们对TALEN和CRISPR/Cas9介导的果蝇基因组同源重组的效率进行了比较。最后，我们首次系统建立并总结了利用TALEN对果蝇进行基因组编辑的技术。以本项目研究作为基础，我们正利用CRISPR/Cas9对果蝇基因组进行系统性基因敲除。该工作有望发展成为一个重大基础性研究项目。本项目共发表文章5篇（包括Cell. Mol. Life Sci., Methods, Biol. Open, J. Genet. Genomics, 等），章节1篇(in “Methods in Molecular Biology”)，培养毕业研究生4名，参加国际学术会议1次，全国性学术会议2次。